L-抗壞血酸棕櫚酸酯的酶法合成

李 紅，陶 靜，李 穎

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

L-抗壞血酸棕櫚酸酯的酶法合成

李 紅，陶 靜，李 穎

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

詳細(xì)研究了脂肪酶在有機(jī)溶劑中催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的反應(yīng)，并且對(duì)影響產(chǎn)物濃度的幾種主要因素進(jìn)行討論(如脂肪酶、溶劑、溫度、底物比、添加劑)，首次通過加入相轉(zhuǎn)移劑提高反應(yīng)產(chǎn)物濃度，確定了合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的最適反應(yīng)條件:3mL叔戊醇為溶劑，催化劑為Novozyme435，其最佳用量為0.05g，底物棕櫚酸與抗壞血酸摩爾比3∶1，0.3g 4A分子篩作為吸水劑，0.3g四丁基溴化銨作為相轉(zhuǎn)移劑，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間72h，得到產(chǎn)物濃度為16.6mg/mL。

L－抗壞血酸棕櫚酸酯，Novozyme435，叔戊醇，四丁基溴化銨

隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)食品和食品添加劑的安全性越來越重視。L－抗壞血酸棕櫚酸酯(圖1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型“綠色”、多功能抗氧化劑。研究已表明，其安全性、穩(wěn)定性和抗氧化性均優(yōu)于目前常用的合成抗氧化劑BHA、BHT等，是世界衛(wèi)生組織、食品藥品聯(lián)合委員會(huì)認(rèn)可的營(yíng)養(yǎng)型抗氧化劑，并為英國(guó)、美國(guó)藥典收載，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和紙制品等領(lǐng)域［1－4］。目前，L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成方法主要有直接酯化法［5－6］、酯交換反應(yīng)法［7－8］、酰鹵酯化法［9］及酶催化合成法［10－13］，其中，酶催化合成法由于具有選擇性高、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品下游分離操作相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高等優(yōu)點(diǎn)，符合清潔生產(chǎn)、綠色化工的發(fā)展趨勢(shì)，越來越受到人們的重視［10－13］。國(guó)內(nèi)湯魯宏［14］等研究了叔戊醇中NOVO 435催化下L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成，產(chǎn)物濃度僅12.5g/L。于是，通過改變反應(yīng)條件，提高產(chǎn)物濃度，成為酶法合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯研究熱點(diǎn)之一。本文針對(duì)該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，考慮通過加入一定量的吸水劑調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中的水分含量，使反應(yīng)向正方向進(jìn)行，此外，水分含量的不同，將影響到反應(yīng)體系中的酶活力，進(jìn)而影響反應(yīng)產(chǎn)物濃度;同時(shí)，因原料中棕櫚酸為脂溶性，而L－抗壞血酸為水溶性的溶解性特點(diǎn)，于是設(shè)想能否通過加入一定量的相轉(zhuǎn)移劑增加有機(jī)相中L－抗壞血酸的量來促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶法合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯工藝的優(yōu)化。

圖1 L－抗壞血酸棕櫚酸酯

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NOVO 435脂肪酶、LIPOLASE脂肪酶、TLIM脂肪酶 河南工業(yè)大學(xué)油脂化學(xué)研究室贈(zèng)送;棕櫚酸、L－抗壞血酸、叔戊醇、己烷、氨水、氯化銨、濃鹽酸、鉬酸銨、硅酸鈉、4A分子篩、四丁基溴化銨、無水硫酸鈉 均為分析純。

BS200S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;85－2型恒溫磁力攪拌器 江蘇中大儀器廠;754型紫外可見分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠;HG101－1B電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;WC－1型顯微熔點(diǎn)儀 溫度未校正，上海光學(xué)儀器廠;Bruker VEC－TOR22型紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司;Agilent LC/MSD Trap XCT質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 L－抗壞血酸脂肪酸酯的合成方法

在由0.5mmol(0.088g)抗壞血酸和1.5mmol(0.384g)棕櫚酸，3m L溶劑組成的反應(yīng)體系中，分別加入0.05g脂肪酶、0.3g吸水劑、0.3g相轉(zhuǎn)移劑四丁基溴化銨，在50℃的恒溫水浴中反應(yīng)，控制轉(zhuǎn)速200 r/m in，反應(yīng)72h后產(chǎn)物濃度用硅鉬蘭分光光度法［15］測(cè)定。

1.2.1 脂肪酶的選擇 在25m L具塞長(zhǎng)試管中分別加入0.088g(0.5mmol)抗壞血酸、0.384g(1.5mmol)的棕櫚酸、0.05g脂肪酶(NOVO435、LIPOLASE和TLIM)、3m L叔戊醇，將試管放入轉(zhuǎn)速為200 r/m in、溫度為50℃的恒溫磁力加熱攪拌器中反應(yīng)，72h后取樣檢測(cè)。

1.2.2 加酶量的選擇 在溫度為50℃，200 r/m in，3m L叔戊醇體系，棕櫚酸與L－抗壞血酸的摩爾比為3∶1，加入0.3g吸水劑、0.3g相轉(zhuǎn)移劑四丁基溴化銨條件下，分別加入 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g 脂肪酶NOVO435，反應(yīng)72h后取樣檢測(cè)。

1.3 L－抗壞血酸脂肪酸酯的紅外光譜測(cè)定

紅外光譜用Bruker VEC－TOR22型紅外光譜儀測(cè)定，KBr壓片，掃描范圍 4000～500cm－1。

1.4 L－抗壞血酸脂肪酸酯的質(zhì)譜測(cè)定條件

質(zhì)譜由Agilent LC/MSD Trap XCT質(zhì)譜儀測(cè)定，采用電噴霧ESI離子源;電子能量70eV;傳輸線溫度275℃;離子源溫度200℃;采用負(fù)離子模式，母離子m/z 413;激活電壓1.5V;質(zhì)量掃描范圍m/z 0～650。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶的選擇

考察了NOVO 435，LIPOLASE，TLIM三種脂肪酶對(duì)L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成反應(yīng)的催化效果，結(jié)果見圖2。

圖2 脂肪酶對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

由圖2可以看出，LIPOLASE脂肪酶幾乎不存在催化此反應(yīng)的功能，TLIM催化效果也比較差，72h后，產(chǎn)物濃度僅0.04mg/m L，NOVO 435催化此反應(yīng)的效果最好，72h之后，產(chǎn)物濃度可達(dá)3.24mg/m L，因此，選擇NOVO 435作為酯化反應(yīng)的催化劑。

2.2 吸水劑對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

由于L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成反應(yīng)是可逆反應(yīng)，而且產(chǎn)物中有水生成，因此，考慮將反應(yīng)體系中加入一定量的吸水劑，促使反應(yīng)向正方向進(jìn)行;此外，水分活度的不同，也將影響到反應(yīng)體系中的酶活力，進(jìn)而影響反應(yīng)產(chǎn)物濃度，于是我們考察了無水Na2SO4及活化的4A分子篩對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，吸水劑無水Na2SO4及4A分子篩的加入可以明顯地促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，且加入4A分子篩要比加入無水Na2SO4效果更好，一方面是因?yàn)槲畡┑募尤胗兄诜磻?yīng)向生成產(chǎn)物的方向進(jìn)行;另一方面可能是因?yàn)槲畡┑募尤胝{(diào)整了反應(yīng)體系的水分活度，更適于脂肪酶作用。因此，我們選擇加入4A分子篩作為吸水劑。

圖3 吸水劑對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

2.3 反應(yīng)溶劑的選擇

反應(yīng)溶劑作為酶反應(yīng)的介質(zhì)直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性。不僅如此，溶劑還能改變酶的特異性。酶在不同的有機(jī)溶劑中活力差別很大，酶活力和溶劑之間可能存在著某種定量關(guān)系模型。而且，L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成反應(yīng)與一般的有機(jī)相合成反應(yīng)有所不同，其底物是由L－抗壞血酸和棕櫚酸組成，而L－抗壞血酸極性很強(qiáng)，棕櫚酸非極性很強(qiáng)，因此要獲得高濃度的產(chǎn)物，就要求反應(yīng)結(jié)束時(shí)，L－抗壞血酸和棕櫚酸的濃度都非常高，該反應(yīng)需選擇一種親水性溶劑，即有一定極性，對(duì)抗壞血酸有一定溶解性，以保證從理論上獲得的產(chǎn)物濃度較高，同時(shí)極性又不宜太強(qiáng)，否則將造成酶的失活。于是研究了分別以水、叔戊醇、正己烷作為反應(yīng)溶劑，結(jié)果見圖4。

圖4 溶劑對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

從圖4看來，水不適合作為此反應(yīng)的介質(zhì)。當(dāng)反應(yīng)在非極性較強(qiáng)的正己烷中反應(yīng)時(shí)，可能由于溶解度的原因，雖然很適合酶的催化反應(yīng)，但對(duì)抗壞血酸的溶解性較差，導(dǎo)致產(chǎn)物濃度依然很低。于是選擇極性處于兩者之間的叔戊醇，得到的產(chǎn)物濃度最高。

2.4 相轉(zhuǎn)移劑對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度影響

在L－抗壞血酸與棕櫚酸的酯化反應(yīng)中，L－抗壞血酸是水溶性的，而棕櫚酸是脂溶性的，兩種反應(yīng)物處在不同的相中，反應(yīng)不容易進(jìn)行。于是考慮通過加入一定量的相轉(zhuǎn)移劑—四丁基溴化銨，增加L－抗壞血酸在叔戊醇相中的溶解度，加速反應(yīng)，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，加入四丁基溴化銨后，產(chǎn)物濃度有所提高，因此，我們選擇加入一定量的相轉(zhuǎn)移劑四丁基溴化銨。

圖5 相轉(zhuǎn)移催化劑對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

溫度對(duì)NOVO 435酶催化L－抗壞血酸與棕櫚酸的酯化反應(yīng)的影響如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

由圖6可見，溫度對(duì)L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成有較大的影響，溫度升高有利于該反應(yīng)進(jìn)行。當(dāng)溫度在30～50℃時(shí)產(chǎn)物濃度迅速上升，在溫度為50℃時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到最高。但溫度超過50℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，L－抗壞血酸棕櫚酸酯的產(chǎn)物濃度反而有所下降，主要是因?yàn)闇囟冗^高使脂肪酶NOVO435逐漸失活，此外，溫度過高也會(huì)破壞抗壞血酸的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響產(chǎn)物濃度。于是將反應(yīng)溫度控制在50℃為宜。

2.6 底物比的選擇

脂肪酶催化該酯化反應(yīng)是L－抗壞血酸和棕櫚酸反應(yīng)生成酯和水的反應(yīng)。要使反應(yīng)徹底，就必須使反應(yīng)物過量，或在反應(yīng)中除去某產(chǎn)物，由于L－抗壞血酸微溶于叔戊醇，且反應(yīng)結(jié)束后，仍有部分固態(tài)L－抗壞血酸，它在反應(yīng)中的濃度可視為定值，因此，可以通過增加棕櫚酸的量促使反應(yīng)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過改變棕櫚酸與L－抗壞血酸的摩爾比，考察對(duì)產(chǎn)物濃度產(chǎn)生的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 底物摩爾比對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

由圖7可見，體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的濃度隨著棕櫚酸和L－抗壞血酸的摩爾比增大而增大，但當(dāng)摩爾比超過3∶1時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物濃度變化已經(jīng)不明顯，說明此時(shí)酶已經(jīng)被底物飽和，體系中過量的棕櫚酸對(duì)反應(yīng)影響較小，因此，選擇最適棕櫚酸和L－抗壞血酸的摩爾比為3∶1。

2.7 體系中加酶量的選擇

脂肪酶固體顆粒直接懸浮于有機(jī)溶劑中，酶的加入量對(duì)于反應(yīng)進(jìn)程有相當(dāng)大的影響。結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質(zhì)量濃度隨酶NOVO 435量的增大而增加，當(dāng)加酶量達(dá)到0.05g時(shí)，繼續(xù)增加脂肪酶的用量，反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量濃度增加緩慢，說明，此時(shí)酶已經(jīng)相對(duì)底物過剩。因此，體系中最適的加酶量為0.05g。

圖8 酶濃度對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

2.8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化情況如圖9所示。

圖9 時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物濃度的影響

由圖9可以看出，反應(yīng)時(shí)間在72h內(nèi)，L－抗壞血酸棕櫚酸酯的濃度迅速上升，超過72h后，產(chǎn)物濃度升高緩慢，說明此時(shí)反應(yīng)已經(jīng)趨于平衡，再延長(zhǎng)時(shí)間并不能有效增加體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質(zhì)量濃度，因此，選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為72h。

2.9 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

由酶催化提純得到的產(chǎn)品為白色粉末，用熔點(diǎn)儀測(cè)定其熔點(diǎn)為110～113℃，在文獻(xiàn)報(bào)道的熔點(diǎn)范圍內(nèi)(107～117℃)。從紅外光譜圖(圖10)中可以看出，在 3404cm－1處出現(xiàn) OH 的吸收峰，在 2918、2850cm－1處出現(xiàn) CH2的 C－H伸縮振動(dòng)吸收峰，在1733cm－1處出現(xiàn)羧酸酯基伸縮振動(dòng)吸收峰，1660cm－1附近的吸收峰為L(zhǎng)－抗壞血酸中C=C雙鍵的吸收峰;指紋區(qū)的吸收峰(1466、1300、719cm－1)進(jìn)一步提供了佐證，符合L－抗壞血酸棕櫚酸酯的結(jié)構(gòu)特征。質(zhì)譜圖(圖11)中的分子離子峰413.2(M－1)更加證實(shí)了產(chǎn)品即為L(zhǎng)－抗壞血酸棕櫚酸酯。

圖10 L－抗壞血酸棕櫚酸酯的紅外光譜

圖11 L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本文研究了一種合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的方法，通過對(duì)催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯反應(yīng)的酶種類和介質(zhì)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在叔戊醇溶劑中用NOVO435催化L－抗壞血酸與棕櫚酸的酯化反應(yīng)得到的產(chǎn)物濃度最高;同時(shí)，對(duì)影響合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的因素(溫度、吸水劑、相轉(zhuǎn)移劑、底物比、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間)進(jìn)行探討，得到了脂肪酶催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的最佳反應(yīng)條件為:3m L叔戊醇作為溶劑，棕櫚酸與L－抗壞血酸的摩爾比為3∶1，酶NOVO435用量為0.05g，以0.3g 4A分子篩作為吸水劑，0.3g四丁基溴化銨作為相轉(zhuǎn)移劑，在50℃下，反應(yīng)72h，反應(yīng)產(chǎn)物濃度可達(dá)16.6%。

［1］R K K Nippon.Antioxidant activity of ascorbic acid and ascorbyl palmitate［J］.New Food Ind，1991，33(6):6－13.

［2］耿志明.L－抗壞血酸棕櫚酸酯特性和應(yīng)用［J］.江蘇食品與發(fā)酵，1997(1):31－36.

［3］D Gopinath，D Ravi，B R Rao.Ascorbyl palmitate vesicles(Aspasomes):formation，characterization and applications ［J］.International Journal of Pharmaceutics，2004，271:95－113.

［4］劉長(zhǎng)波，高瑞昶.L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成研究進(jìn)展［J］.中國(guó)油脂，2003，28(10):46－49.

［5］P A Seib，R C Cousins，R CHoseney.Method of synthesizing fatty acid esters of ascorbic acid［P］.US:4151178，1979－04.

［6］Gruetsmacher.Preparation of erythorbic acid and ascorbic acid 6－fatty acid esters［P］.US:4289702，1981－09－15.

［7］龔大春，周強(qiáng)，席祖江.L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成工藝研究［J］.沈陽化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，14(3):199－200.

［8］蔡力創(chuàng)，呂積國(guó)，劉瑾，等.室溫條件棕櫚酸合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的研究［J］.江西科學(xué)，1999，17(4):215－219.

［9］陸豫，甘利軍，陳葆仁.L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成［J］.精細(xì)化工，1996，13(3):17－18.

［10］CHumeau，M Girardin，B Rove，et al.Effect of the thermo dynamic water activity and the reaction medium hydrophobicity on the enzymatic synthesis of ascrobyl palmitate［J］.Journal of Biotechnology，1998，63:1－8.

［11］Y Yan，TB Uwe，R D Schmid.Lipase－catalyzed synthesis of vitaminC fatty acid esters ［J］.Biotechnology Letters，1999，21:1051－1054.

［12］S Park，F(xiàn) Viklund，K Hult，et al.Vacuum－driven lipasecatalysed direct condensation of L－ascorbic acid and fatty acids in ionic liquids:synthesis of a natural surface active antioxidant［J］.Green Chemistry，2003(5):715－719.

［13］Q X Song，Y Zhao，W Q Xu，et al.Enzymatic synthesis of L－ascorbyl linoleate in organic media ［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2006，28:211－215.

［14］湯魯宏，張浩.催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的反應(yīng)媒體和脂肪［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19(2):157－159.

［15］湯魯宏，張浩.硅鉬蘭分光光度法測(cè)定微量L－抗壞血酸棕櫚酸酯［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2000，15(1):37－39.

Synthesis of L－ascorbyl palmitate catalyzed by lipase

LIHong，TAO Jing，LIYing

(School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

The synthesis of L－ascorbyl palmitate catalyzed by lipase in organic phase was studied.The optimized process conditions，such as enzyme，solvent，temperature，reactants and additive were determined.In the presence of0.05g Novozyme 435 as catalyst，0.3g of 4A molecular sieve and 0.3g of n－Bu4NBr as additive in 3m Ltert－amyl alcohol at 50℃，16.6mg/m L of L－ascorbyl palmitate was obtained in the reaction of palm itic acid and VCwith the molar ratio of 3∶1 after 72h.

L－ascorbyl palmitate;Novozyme 435;tert－am yl alcohol;tetrabutylammonium bromide

TS202.3

A

1002－0306(2011)08－0350－04

2010－01－07

李紅(1978－)，女，博士，副教授，主要從事食品化學(xué)方面的研究工作。

鄭州輕工業(yè)學(xué)院2008年博士基金項(xiàng)目(000420)。