• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大米濃縮蛋白酶法改性與功能性質(zhì)評價(jià)

    2011-11-06 08:36:04唐俊妮
    食品工業(yè)科技 2011年8期
    關(guān)鍵詞:溶解性分子量蛋白酶

    劉 驥,唐俊妮

    (西南民族大學(xué),四川成都610041)

    大米濃縮蛋白酶法改性與功能性質(zhì)評價(jià)

    劉 驥,唐俊妮*

    (西南民族大學(xué),四川成都610041)

    以大米濃縮蛋白(rice protein concentrate,RPC)為原料,利用堿性蛋白酶(Alcalase)改性。探討了在最適條件下,即底物濃度5%、酶與底物比例0.8%、pH8.5、55℃,經(jīng)過改性制得改性大米濃縮蛋白(modified rice protein concentrate,MRPC)的功能性質(zhì):氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%、乳化活性(EA=0.101)、乳化穩(wěn)定性(ES=26.7%)、表面疏水性(2627.6)以及分子量分布。研究表明,經(jīng)過Alcalase改性后的MRPC與大豆分離蛋白接近,具有作為食品蛋白質(zhì)添加劑開發(fā)的潛力。

    大米濃縮蛋白,堿性蛋白酶,改性,功能性質(zhì)

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    大米濃縮蛋白(RPC) 制備方法見參考文獻(xiàn)[3],制得RPC溶解性小于0.5%;各類食品級蛋白酶制劑 包括:Neutrase、Alcalase、Protamex和胰蛋白酶Novo,由丹麥Novozymes提供;Papain木瓜蛋白酶 上海聚源生物工程公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

    CS501型超級恒溫水浴 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠; PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;94-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器 上海志威電器有限公司;250mL玻璃夾套酶反應(yīng)器 循環(huán)水恒溫,定做;ALPHA 1-4型冷凍干燥機(jī) 德國制造;722型光柵分光光度計(jì)無錫科達(dá)智能儀器廠;Waters 2790高效液相色譜儀Waters公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

    1.2.1.1 不同蛋白酶對于RPC增溶的效率 各種食品級蛋白酶在說明書推薦最適作用條件下作用于RPC,底物(RPC)濃度為5%,其它條件如下:a.胰蛋白酶Novo:E∶S=2%,pH8.0,45℃;b.Protamex:E∶S= 1%,pH7.0,40℃;c.Neutrase:E∶S=2%,pH7.0,40℃; d.Papain木瓜蛋白酶:E∶S=2%,pH7.0,40℃; e.Alcalase:E∶S=0.8%,pH8.5,40℃。酶反應(yīng)過程中,用pH-stat法控制反應(yīng)體系pH在該種酶的最適pH。取上清液通過Folin-酚比色測定不同酶反應(yīng)時(shí)間的蛋白溶出率。

    1.2.1.2 Alcalase改性蛋白最適反應(yīng)條件 參考文獻(xiàn)[9]。

    1.2.2 MRPC功能性質(zhì)評價(jià)

    1.2.2.1 MRPC的溶解性 依據(jù)C.V.Morr[10]的方法略做修改:取1g的RPC,加入50mL水,用0.1N HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,25℃,攪拌1h,定容至100mL,離心(3000r/min,20min),收集上清液,通過Folin-酚比色測定經(jīng)過不同水解時(shí)間后,改性蛋白在不同pH時(shí)的溶解性,以及改性蛋白等電點(diǎn)的溶解性。Folin-酚比色法結(jié)果用溶出蛋白量(mg/mL)表示。

    1.2.2.2 MRPC的乳化活性 采用濁度法,利用乳化界面的面積與渾濁度存在簡單相關(guān)關(guān)系的原理。配制濃度為0.2%的蛋白質(zhì)溶液(pH的混合磷酸鹽緩沖液),取75mL該溶液,加入25mL大豆色拉油,在10000r/min下均質(zhì)2min,用微量取樣器迅速從底部取乳化液10μL稀釋于5mL的0.1%SDS溶液中,以0.1%SDS溶液為參比,立即用分光光度計(jì)在500nm測定吸光值(A),乳化活性(EA)用吸光值表示。

    1.2.2.3 MRPC的乳化穩(wěn)定性 測定乳化活性后的乳液在80℃水浴中加熱30min,冷卻至室溫,搖勻,按上述方法測定乳化活性(EA80),按下式計(jì)算乳化穩(wěn)定性:乳化穩(wěn)定性(ES,%)=EA80/EA

    1.2.2.4 MRPC的表面疏水性 將水解不同時(shí)間的蛋白水解液滅酶,離心,取上清,用0.01mol/L、pH7.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液稀釋至0.002%、0.004%、0.008%、0.016%,取20μL 1-anilino-8-naphthalene溶液(8mmol/L溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)加入4mL上述配制的蛋白溶液(注意避光),立即搖勻,在熒光分光光度計(jì)中于390nm激發(fā),470nm檢測發(fā)射熒光強(qiáng)度,用熒光強(qiáng)度對蛋白溶液濃度作圖并進(jìn)行線性回歸,以線性回歸斜率作為表面疏水性的指標(biāo)。

    1.2.2.5 MRPC的分子量分布 采用高壓液相(HPLC)測定MRPC分子量分布:將水解不同時(shí)間的蛋白水解液滅酶,離心,取上清,過0.45μm微孔濾膜,進(jìn)高效凝膠柱Protein KW-803。洗脫液0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0,0.3mol/L NaCl),流速1mL/min,紫外檢測波長280nm。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同蛋白酶對RPC增溶效率

    如圖1所示,Trypsin和Alcalase在反應(yīng)初期和反應(yīng)5h結(jié)束時(shí),RPC溶出量明顯大于其它三種酶的作用效果。與Alcalase相比,在Trypsin作用下,反應(yīng)初期溶出速率較快(曲線斜率較大);在Alcalase作用下的反應(yīng)末期,溶出速率略大于Trypsin作用下的溶出速率。這種差異可能主要是由于Trypsin酶作用的專一性帶來的,在反應(yīng)初期易被Trypsin作用的敏感鍵(Arg和Lys的羧基參與形成的肽鍵)較多,且其水解產(chǎn)物的末端氨基酸側(cè)鏈帶電荷,因而更容易溶出。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,這類肽鍵大量減少,因此,溶出速率明顯下降。然而Alcalase是一種專一性遠(yuǎn)不如Trypsin的肽鏈內(nèi)切酶,在反應(yīng)末期可能還剩下略多的敏感鍵(不局限于Arg和Lys的羧基參與形成的肽鍵),所以在反應(yīng)末期Alcalase作用下,溶出速率略大(曲線斜率較大)。但是對于為什么反應(yīng)初期Alcalase作用下,溶出速率低于Trypsin作用下的溶出速率的問題,從敏感鍵的角度來看,反應(yīng)初期易被Alcalase作用的敏感鍵的數(shù)量有可能是大于易被Trypsin作用的敏感鍵數(shù)量,分析原因可能如下:蛋白酶法增溶反應(yīng)中,不能排除如下因素——即使有些肽鍵被蛋白酶作用斷裂,但是蛋白質(zhì)仍然可能保持在固相中并不溶出。所以,敏感鍵數(shù)量雖多,卻并不一定導(dǎo)致蛋白溶出速率更大。這也從一定程度上說明水解度(DH)不適合描述液固兩相反應(yīng)進(jìn)行的程度。為了工藝上能合理地控制這一條件下的水解反應(yīng),并確定反應(yīng)的程度,在本研究中采用水解時(shí)間與蛋白溶出量關(guān)系來描述反應(yīng)進(jìn)程。

    圖1 不同蛋白酶的增溶效率

    綜合考慮生產(chǎn)成本的因素,Alcalase增溶效率較高且價(jià)格比Trypsin便宜,從工業(yè)應(yīng)用的角度選擇Alcalase更為有利。

    2.2 MRPC的溶解性

    圖2所示,經(jīng)過短時(shí)間Alcalase處理后的RPC,呈現(xiàn)典型的U型溶解曲線,隨著時(shí)間增加,U形的谷底緩慢消失,最后變?yōu)樵诓煌膒H下廣泛可溶。圖3表明等電點(diǎn)溶解性隨酶解時(shí)間增加而增加,在反應(yīng)最初10min時(shí)等電點(diǎn)溶解性增加較為顯著。隨著反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行至60min,等電點(diǎn)溶解性幾乎達(dá)到最高。綜上可知,僅從RPC增溶程度來看,水解60min可達(dá)到提高溶解性的基本要求,不需要水解300min,這樣可以降低生產(chǎn)成本。

    測定經(jīng)過60min水解的RPC氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%,可見RPC改性后溶解性得到較大的提高(改性前NSI低于0.5%),是一種有應(yīng)用潛力的食品蛋白添加劑。

    2.3 MRPC的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

    由圖4可見,隨著水解時(shí)間的增大,乳化活性先增大后減小,然后又略有增大,在維持較長一段時(shí)間的平衡后,在水解300min時(shí)乳化活性顯著增大。與之相反的是,乳化穩(wěn)定性先減小后增大,隨后再減小后增大,在水解300min時(shí)乳化穩(wěn)定性最小。值得注意的是,乳化活性的峰頂正好對應(yīng)乳化穩(wěn)定性的峰谷,而乳化活性的峰谷正好對應(yīng)乳化穩(wěn)定性的峰頂。這一對應(yīng)關(guān)系較好地說明良好的乳化活性劑未必同時(shí)是良好的乳化穩(wěn)定劑。這是因?yàn)榫哂辛己萌榛钚缘奈镔|(zhì)應(yīng)該能快速地?cái)U(kuò)散到界面上,相應(yīng)在界面上不會太穩(wěn)定。而具有良好乳化穩(wěn)定性的物質(zhì),可能在界面上形成一層比較穩(wěn)定的膜,因此雖然難以快速地?cái)U(kuò)散并鋪展至界面(乳化活性差),但是乳化穩(wěn)定性較好。

    圖2 水解時(shí)間對RPC溶解性的影響

    圖3 MRPC等電點(diǎn)溶解性

    圖4 MRPC乳化性和乳化穩(wěn)定性與水解時(shí)間的關(guān)系

    表1 改性RPC與大豆分離蛋白界面特性的比較a

    與大豆分離蛋白對比發(fā)現(xiàn):在水解60min時(shí),雖然MRPC乳化活性與乳化穩(wěn)定性較大豆蛋白略低,這可能與RPC溶解性較低有關(guān);但是仍然不失為一種有開發(fā)潛力的廉價(jià)的食品乳化劑。

    2.4 MRPC的表面疏水性

    圖5為MRPC的表面疏水性與水解時(shí)間的關(guān)系,總的看來,表面疏水性隨著水解的進(jìn)行呈下降趨勢,但是水解10min后表面疏水性基本不再變化。水解60min時(shí)的表面疏水性為2627.6。因此,可以使用蛋白酶水解的方式在一定程度上減小表面疏水性,提高溶解度。

    圖5 RPC表面疏水性與水解時(shí)間的關(guān)系

    2.5 改性后上清液中RPC的分子量分布

    如圖6所示,隨水解時(shí)間增加,MRPC分子量分布有較明顯的變化,總的趨勢是高分子量部分減少,低分子量部分增大。未水解時(shí)(水解0min),根據(jù)分子篩分離蛋白原則,分子量分布基本上可分為三個(gè)部分,分別為:F1(極高分子量組分)、F3(中等分子量組分)、F4(低分子量組分);水解最初(2min)時(shí),F(xiàn)1消失,同時(shí)增加了一個(gè)較為明顯的F2(高分子量組分)部分,這很可能是F1以及不溶性RPC的水解產(chǎn)物;隨著水解的進(jìn)一步進(jìn)行,F(xiàn)2減少,相應(yīng)的F3增加;水解至60min時(shí),F(xiàn)2減少較多,F(xiàn)4部分有所增加;最后在水解至300min時(shí),F(xiàn)3和F4兩個(gè)部分為水解產(chǎn)物的主要部分。表2說明隨著水解的進(jìn)行,F(xiàn)2部分先增加后減少;F3呈先減少后增加的趨勢;F4部分隨水解時(shí)間的增加不斷增加。

    圖6 不同水解時(shí)間改性后上清液中RPC分子量分布

    表2 不同水解時(shí)間各部分水解產(chǎn)物的相對含量

    3 結(jié)論

    利用Alcalase在最適條件下,即底物濃度5%、酶與底物比例0.8%、pH8.5、55℃,改性大米濃縮蛋白(RPC),得到產(chǎn)品MRPC氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%,乳化活性(EA)為0.101,乳化穩(wěn)定性(ES,%)為26.7%,與大豆分離蛋白接近;Alcalase作用可以降低大米濃縮蛋白的表面疏水性,同時(shí)改進(jìn)蛋白產(chǎn)品的分子量分布。如果結(jié)合其它改性方法,如高壓均質(zhì)及化學(xué)改性等方法,可以進(jìn)一步提高RPC的溶解性;對MRPC的水解產(chǎn)物進(jìn)一步利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián),可以改善RPC分子表面親水/疏水微區(qū)分布,提高乳化活性和乳化穩(wěn)定性。總之,改性大米濃縮蛋白(RPC)是一種具有開發(fā)潛力的功能性食品蛋白質(zhì)添加劑。

    [1]Murata K,Tanaka Y,Kawaguchi T.Comparision between nutritional value of rice and wheat protein[J].Nutrition Reports International,1973,22(6):93-96.

    [2]王金華.兩種蛋白酶對米渣蛋白的酶促降解作用[J].食品工業(yè)科技,2002,23(12):13-15.

    [3]劉驥.姚惠源.陳正行.利用米渣為原料制備大米濃縮蛋白[J].食品工業(yè),2004,25(3):11-13.

    [4]K C Chang,C C Lee,G Brown.Production and nutritional evaluation of high-protein rice flour[J].J Food Sci,1986,51: 464-467.

    [5]Jei-Fu SHAW,Jyh-Rong SHEU.Production of Highmaltose Syrup and flour from Rice by an Enzymatic Method[J]. Biosci Biotech Biochem,1992,56(7):1071-1073.

    [6]Frederick F,Shih,Kim W Daigle.Use of Enzyme for the Separation of Protein from Rice Flour[J].Cereal Chem,1997,74 (5):437-441.

    [7] Frederick F,Shih,Kim W Daigle.Preparation and characterization of rice protein isolates[J].JAOCS,2000,77(8): 885-889.

    [8]劉驥,鄧依.高溫液化工藝對大米蛋白溶解性的影響[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(6):18-21.

    [9]劉驥,姚惠源,陳正行.米渣濃縮蛋白酶法增溶機(jī)理初探[J].食品科學(xué),2007,28(2):214-219.

    [10]C V Morr,B German,J E Kinsella,et al.A collaborative study to develop a standardized food protein solubility procedure[J].J Food Sci,1985,50(6):1715-1718.

    [11]黃友如.醇洗豆粕對大豆分離蛋白的提取及其功能性質(zhì)的影響[D].無錫:江南大學(xué),2003:40-41.

    Enzymatic modification of rice protein concentrate and functional properties of the hydrolysates

    LIU Ji,TANG Jun-ni*
    (School of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

    A potential food protein additive of rice protein concentrate(RPC),was modified by Alcalase at the optimal conditions(concentration of substrate 5%,the ratio of enzyme to substrate 0.8%,pH 8.5,55℃)to improve its functionality in food system.Our research revealed that the functionalities of RPC,including nitrogen solubility index(NSI=52.9%),emulsifying activity(EA=0.101),emulsifying stability(ES=26.7%),surface hydrophobicity (2627.6)and distribution of molecule weight,were promoted by Alcalase hydrolysis and the application of MRPC was extended.

    rice protein concentrate(RPC);Alcalase;modification;functionality

    TS210.1

    A

    1002-0306(2011)08-0206-04

    雖然大米蛋白的營養(yǎng)價(jià)值高于小麥蛋白質(zhì)[1],但是由于大米中蛋白含量較低(6%~9%),且主要是溶解性較差的谷蛋白和醇溶蛋白,因此從大米中直接提取米濃縮蛋白和分離蛋白成本太高,且蛋白產(chǎn)品的功能性質(zhì)也較差,無商業(yè)價(jià)值。研究證實(shí),從米淀粉深加工的副產(chǎn)物米渣中制備大米濃縮或分離蛋白(純度達(dá)90%),具有經(jīng)濟(jì)可行性[2-8],但是由于米蛋白在淀粉高溫液化工藝過程中,受到長時(shí)間的熱處理,溶解性能顯著降低。為了進(jìn)一步提高從米渣中制備RPC在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍,應(yīng)對其進(jìn)行改性。酶反應(yīng)動力學(xué)研究表明,RPC在Alcalase作用下遵守液固兩相反應(yīng)的動力學(xué)。堿性蛋白酶(Alcalase)降解不溶性蛋白組分可能符合“Zipper Reaction”模型[9]。因此,用水解度(DH)表征水解反應(yīng)進(jìn)程受到限制。為了更好地控制這一條件下的水解反應(yīng),并確定反應(yīng)的程度,在本研究中采用水解時(shí)間與蛋白溶出量的關(guān)系來描述反應(yīng)進(jìn)程。本研究針對從米淀粉深加工副產(chǎn)物中制備的RPC為原料,進(jìn)行蛋白酶法改性,并對改性產(chǎn)品功能性質(zhì)進(jìn)行評價(jià),研究高效廉價(jià)的改性方法,為進(jìn)一步拓寬大米蛋白應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    2010-08-02 *通訊聯(lián)系人

    劉驥(1978-),男,碩士,講師,研究方向:食品資源開發(fā)與利用。

    國家自然基金項(xiàng)目(31071515);西南民族大學(xué)中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(09NZYZJ04)。

    猜你喜歡
    溶解性分子量蛋白酶
    共沉淀引發(fā)的溶解性有機(jī)質(zhì)在水鐵礦/水界面的分子分餾特性*
    加入超高分子量聚合物的石墨烯纖維導(dǎo)電性優(yōu)異
    垃圾滲濾液溶解性有機(jī)物的分子指紋特征
    思鄉(xiāng)與蛋白酶
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
    改良的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測胸腺肽分子量
    溶解性有機(jī)質(zhì)對水中重金屬生物有效性的影響研究
    多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
    不同對照品及GPC軟件對右旋糖酐鐵相對分子量測定的影響
    低分子量丙烯酰胺對深部調(diào)驅(qū)采出液脫水的影響
    IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價(jià)值
    国产中年淑女户外野战色| 久久久久久国产a免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 99久久九九国产精品国产免费| 99久久九九国产精品国产免费| 日韩欧美在线乱码| 可以在线观看毛片的网站| 狂野欧美激情性xxxx| 久99久视频精品免费| 一级作爱视频免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 国产精华一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线 | 欧美另类亚洲清纯唯美| а√天堂www在线а√下载| 久久久成人免费电影| 观看美女的网站| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产男靠女视频免费网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 身体一侧抽搐| 网址你懂的国产日韩在线| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇的逼好多水| 久久久久久大精品| av视频在线观看入口| 免费看十八禁软件| 亚洲成av人片免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩欧美国产在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 男女午夜视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 可以在线观看的亚洲视频| 中文字幕久久专区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 无遮挡黄片免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产中年淑女户外野战色| 一区二区三区国产精品乱码| 在线观看av片永久免费下载| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美不卡视频在线免费观看| avwww免费| 岛国在线免费视频观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 俄罗斯特黄特色一大片| 两人在一起打扑克的视频| 中文资源天堂在线| 免费看a级黄色片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 在线观看日韩欧美| 日日夜夜操网爽| 1000部很黄的大片| 国产高清视频在线观看网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产综合懂色| 精品福利观看| 亚洲片人在线观看| 久久亚洲真实| 亚洲不卡免费看| 亚洲色图av天堂| 久久亚洲精品不卡| 深爱激情五月婷婷| 国产精品 国内视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 天堂影院成人在线观看| 亚洲色图av天堂| 久久99热这里只有精品18| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲国产精品久久男人天堂| 黄色日韩在线| 黄色女人牲交| 亚洲精品久久国产高清桃花| xxx96com| 欧美日韩黄片免| 国产成人福利小说| 一进一出抽搐动态| 国产亚洲精品av在线| 色在线成人网| 亚洲av第一区精品v没综合| 99久久综合精品五月天人人| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产一区二区在线观看日韩 | 又黄又粗又硬又大视频| av中文乱码字幕在线| 99国产综合亚洲精品| 少妇的丰满在线观看| 成人国产综合亚洲| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 真实男女啪啪啪动态图| 色哟哟哟哟哟哟| 国产黄a三级三级三级人| 在线观看日韩欧美| 在线国产一区二区在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费大片18禁| 国产v大片淫在线免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| www.www免费av| 日本一本二区三区精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久久久午夜电影| 99久久精品国产亚洲精品| 国产免费男女视频| 少妇丰满av| 一区二区三区免费毛片| 亚洲人成网站高清观看| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美3d第一页| 免费无遮挡裸体视频| 高清日韩中文字幕在线| 午夜精品在线福利| a级一级毛片免费在线观看| av中文乱码字幕在线| 岛国在线免费视频观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 有码 亚洲区| 国产亚洲欧美98| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品一及| 在线观看日韩欧美| 欧美+日韩+精品| 一a级毛片在线观看| 成人无遮挡网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 悠悠久久av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产v大片淫在线免费观看| 久久国产精品影院| 天堂动漫精品| 国产视频内射| 色老头精品视频在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 18美女黄网站色大片免费观看| 三级毛片av免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 美女免费视频网站| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一级黄片播放器| 国产探花在线观看一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲欧美日韩东京热| 看片在线看免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| h日本视频在线播放| 村上凉子中文字幕在线| 国产主播在线观看一区二区| 麻豆国产97在线/欧美| 日本 欧美在线| 国产视频内射| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美av亚洲av综合av国产av| 九九热线精品视视频播放| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲国产色片| 日本一本二区三区精品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 91久久精品国产一区二区成人 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一本一本综合久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲片人在线观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲在线观看片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久人妻av系列| 在线观看66精品国产| 看黄色毛片网站| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲精品成人久久久久久| 久久久久久国产a免费观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久草成人影院| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久久久人人人人人| 高清日韩中文字幕在线| 日本 欧美在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日本一本二区三区精品| 小说图片视频综合网站| 热99在线观看视频| 两个人视频免费观看高清| 一级黄片播放器| 9191精品国产免费久久| av中文乱码字幕在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| a级一级毛片免费在线观看| 最新中文字幕久久久久| 青草久久国产| 搞女人的毛片| 免费电影在线观看免费观看| 51国产日韩欧美| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产一区二区在线av高清观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 我的老师免费观看完整版| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久人妻av系列| 好男人电影高清在线观看| 国产高清激情床上av| 老司机深夜福利视频在线观看| h日本视频在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人福利小说| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲avbb在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 天堂√8在线中文| 久久久久九九精品影院| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久6这里有精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一区二区三区高清视频在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费在线观看成人毛片| 波野结衣二区三区在线 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 在线观看66精品国产| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美大码av| 日本与韩国留学比较| 黄片大片在线免费观看| 免费av观看视频| 美女黄网站色视频| 婷婷丁香在线五月| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 老鸭窝网址在线观看| 人人妻人人看人人澡| 国产精品久久久久久精品电影| 免费在线观看成人毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| а√天堂www在线а√下载| 丁香六月欧美| www.色视频.com| 成人鲁丝片一二三区免费| 悠悠久久av| 日本 欧美在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 在线观看66精品国产| 香蕉丝袜av| 欧美一级a爱片免费观看看| 热99在线观看视频| 国产69精品久久久久777片| 欧美日韩黄片免| 亚洲黑人精品在线| 中文资源天堂在线| 哪里可以看免费的av片| 成人18禁在线播放| 成人三级黄色视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | h日本视频在线播放| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲在线自拍视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本黄色片子视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲av成人av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 真人做人爱边吃奶动态| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久久久久大av| 国产精品av视频在线免费观看| 国产伦人伦偷精品视频| 99热这里只有精品一区| 日韩欧美国产一区二区入口| 给我免费播放毛片高清在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 超碰av人人做人人爽久久 | 国产伦精品一区二区三区视频9 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 高清毛片免费观看视频网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 综合色av麻豆| 免费人成在线观看视频色| 精品国产美女av久久久久小说| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 97碰自拍视频| 久9热在线精品视频| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲美女视频黄频| 性欧美人与动物交配| 精品电影一区二区在线| 一本一本综合久久| 国产视频一区二区在线看| 欧美zozozo另类| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产欧美人成| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成年女人毛片免费观看观看9| 好男人电影高清在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久精品国产综合久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品久久久久久久久免 | 一进一出好大好爽视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 色在线成人网| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 成年人黄色毛片网站| 九九在线视频观看精品| 天天躁日日操中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 一个人免费在线观看电影| 18+在线观看网站| 国产av不卡久久| 国产成人a区在线观看| 久久99热这里只有精品18| 亚洲avbb在线观看| eeuss影院久久| 免费看日本二区| 精品人妻1区二区| 三级毛片av免费| 日韩免费av在线播放| 最近在线观看免费完整版| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99riav亚洲国产免费| 欧美日韩精品网址| 岛国在线免费视频观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 乱人视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 看片在线看免费视频| 国产一区二区在线av高清观看| 免费观看精品视频网站| 国产高清视频在线观看网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产成年人精品一区二区| 最新美女视频免费是黄的| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产成人av教育| 老司机在亚洲福利影院| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩东京热| а√天堂www在线а√下载| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日本 欧美在线| 亚洲色图av天堂| 国产精品 国内视频| 国产精品1区2区在线观看.| 中亚洲国语对白在线视频| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲五月天丁香| 日本成人三级电影网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久性视频一级片| 国产午夜福利久久久久久| 成年人黄色毛片网站| 1000部很黄的大片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 神马国产精品三级电影在线观看| av片东京热男人的天堂| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 五月伊人婷婷丁香| 99热这里只有精品一区| www.色视频.com| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99国产精品一区二区蜜桃av| 麻豆一二三区av精品| 亚洲美女视频黄频| 国产亚洲欧美98| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜精品在线福利| 一本综合久久免费| 国产私拍福利视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久精品国产综合久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 成年免费大片在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 51午夜福利影视在线观看| 日本一本二区三区精品| 最新中文字幕久久久久| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美日韩黄片免| 欧美成人一区二区免费高清观看| 搞女人的毛片| 成人特级av手机在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | a级一级毛片免费在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品久久久久久久久免 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99在线视频只有这里精品首页| 日韩人妻高清精品专区| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品 欧美亚洲| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 嫩草影视91久久| 欧美3d第一页| 少妇丰满av| 制服人妻中文乱码| 国产av不卡久久| 欧美大码av| 精品国产三级普通话版| 天堂影院成人在线观看| www.999成人在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品久久久久久,| 校园春色视频在线观看| 久久久久久久久久黄片| 波多野结衣巨乳人妻| 国产伦人伦偷精品视频| 99视频精品全部免费 在线| 精品一区二区三区视频在线 | 婷婷六月久久综合丁香| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久久久大精品| 国产精品国产高清国产av| 十八禁人妻一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 精品久久久久久,| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 十八禁网站免费在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 两个人视频免费观看高清| 欧美区成人在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 美女免费视频网站| xxx96com| 极品教师在线免费播放| 亚洲专区国产一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 五月伊人婷婷丁香| 精品一区二区三区av网在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲精品在线美女| 在线看三级毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲在线自拍视频| 极品教师在线免费播放| 又紧又爽又黄一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产高清视频在线观看网站| 国产午夜精品论理片| 亚洲黑人精品在线| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产亚洲精品一区二区www| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩人妻高清精品专区| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲专区中文字幕在线| 好男人在线观看高清免费视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 俺也久久电影网| 全区人妻精品视频| 男插女下体视频免费在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 一夜夜www| 国产探花在线观看一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产久久久一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久草成人影院| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 伊人久久精品亚洲午夜| 日本a在线网址| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费大片18禁| 国产亚洲精品av在线| 18禁在线播放成人免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日韩欧美免费精品| 国产午夜精品论理片| 性色av乱码一区二区三区2| 特级一级黄色大片| 51午夜福利影视在线观看| 岛国在线观看网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久国内视频| 国产男靠女视频免费网站| 级片在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 黄色日韩在线| 精品无人区乱码1区二区| 久久亚洲精品不卡| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日日干狠狠操夜夜爽| 我的老师免费观看完整版| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99国产精品一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 狂野欧美激情性xxxx| 99热只有精品国产| 国产亚洲精品av在线| 十八禁人妻一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产高清三级在线| av在线天堂中文字幕| 国产黄片美女视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 国产三级中文精品| 久久伊人香网站| 九九热线精品视视频播放| 在线观看66精品国产| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一进一出好大好爽视频| 国产精品亚洲美女久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 天堂网av新在线| 久久6这里有精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| svipshipincom国产片| 一个人免费在线观看的高清视频| 99视频精品全部免费 在线| 色视频www国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本 欧美在线| 男人舔奶头视频| 观看免费一级毛片| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久久人人人人人| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 免费在线观看成人毛片| 97超视频在线观看视频| 国内精品一区二区在线观看| 无人区码免费观看不卡| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产色片| www.色视频.com| 特级一级黄色大片| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产一区二区在线av高清观看| 波野结衣二区三区在线 | 好男人电影高清在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 色综合站精品国产| 亚洲国产高清在线一区二区三| 色av中文字幕| 嫩草影院精品99| 身体一侧抽搐| 成人18禁在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲专区中文字幕在线| 观看免费一级毛片| 日韩av在线大香蕉| 国产野战对白在线观看| 成人欧美大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 少妇的逼水好多| 日本一二三区视频观看|