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    大米濃縮蛋白酶法改性與功能性質(zhì)評價(jià)

    2011-11-06 08:36:04唐俊妮
    食品工業(yè)科技 2011年8期
    關(guān)鍵詞:溶解性分子量蛋白酶

    劉 驥,唐俊妮

    (西南民族大學(xué),四川成都610041)

    大米濃縮蛋白酶法改性與功能性質(zhì)評價(jià)

    劉 驥,唐俊妮*

    (西南民族大學(xué),四川成都610041)

    以大米濃縮蛋白(rice protein concentrate,RPC)為原料,利用堿性蛋白酶(Alcalase)改性。探討了在最適條件下,即底物濃度5%、酶與底物比例0.8%、pH8.5、55℃,經(jīng)過改性制得改性大米濃縮蛋白(modified rice protein concentrate,MRPC)的功能性質(zhì):氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%、乳化活性(EA=0.101)、乳化穩(wěn)定性(ES=26.7%)、表面疏水性(2627.6)以及分子量分布。研究表明,經(jīng)過Alcalase改性后的MRPC與大豆分離蛋白接近,具有作為食品蛋白質(zhì)添加劑開發(fā)的潛力。

    大米濃縮蛋白,堿性蛋白酶,改性,功能性質(zhì)

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    大米濃縮蛋白(RPC) 制備方法見參考文獻(xiàn)[3],制得RPC溶解性小于0.5%;各類食品級蛋白酶制劑 包括:Neutrase、Alcalase、Protamex和胰蛋白酶Novo,由丹麥Novozymes提供;Papain木瓜蛋白酶 上海聚源生物工程公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

    CS501型超級恒溫水浴 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠; PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;94-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器 上海志威電器有限公司;250mL玻璃夾套酶反應(yīng)器 循環(huán)水恒溫,定做;ALPHA 1-4型冷凍干燥機(jī) 德國制造;722型光柵分光光度計(jì)無錫科達(dá)智能儀器廠;Waters 2790高效液相色譜儀Waters公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

    1.2.1.1 不同蛋白酶對于RPC增溶的效率 各種食品級蛋白酶在說明書推薦最適作用條件下作用于RPC,底物(RPC)濃度為5%,其它條件如下:a.胰蛋白酶Novo:E∶S=2%,pH8.0,45℃;b.Protamex:E∶S= 1%,pH7.0,40℃;c.Neutrase:E∶S=2%,pH7.0,40℃; d.Papain木瓜蛋白酶:E∶S=2%,pH7.0,40℃; e.Alcalase:E∶S=0.8%,pH8.5,40℃。酶反應(yīng)過程中,用pH-stat法控制反應(yīng)體系pH在該種酶的最適pH。取上清液通過Folin-酚比色測定不同酶反應(yīng)時(shí)間的蛋白溶出率。

    1.2.1.2 Alcalase改性蛋白最適反應(yīng)條件 參考文獻(xiàn)[9]。

    1.2.2 MRPC功能性質(zhì)評價(jià)

    1.2.2.1 MRPC的溶解性 依據(jù)C.V.Morr[10]的方法略做修改:取1g的RPC,加入50mL水,用0.1N HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,25℃,攪拌1h,定容至100mL,離心(3000r/min,20min),收集上清液,通過Folin-酚比色測定經(jīng)過不同水解時(shí)間后,改性蛋白在不同pH時(shí)的溶解性,以及改性蛋白等電點(diǎn)的溶解性。Folin-酚比色法結(jié)果用溶出蛋白量(mg/mL)表示。

    1.2.2.2 MRPC的乳化活性 采用濁度法,利用乳化界面的面積與渾濁度存在簡單相關(guān)關(guān)系的原理。配制濃度為0.2%的蛋白質(zhì)溶液(pH的混合磷酸鹽緩沖液),取75mL該溶液,加入25mL大豆色拉油,在10000r/min下均質(zhì)2min,用微量取樣器迅速從底部取乳化液10μL稀釋于5mL的0.1%SDS溶液中,以0.1%SDS溶液為參比,立即用分光光度計(jì)在500nm測定吸光值(A),乳化活性(EA)用吸光值表示。

    1.2.2.3 MRPC的乳化穩(wěn)定性 測定乳化活性后的乳液在80℃水浴中加熱30min,冷卻至室溫,搖勻,按上述方法測定乳化活性(EA80),按下式計(jì)算乳化穩(wěn)定性:乳化穩(wěn)定性(ES,%)=EA80/EA

    1.2.2.4 MRPC的表面疏水性 將水解不同時(shí)間的蛋白水解液滅酶,離心,取上清,用0.01mol/L、pH7.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液稀釋至0.002%、0.004%、0.008%、0.016%,取20μL 1-anilino-8-naphthalene溶液(8mmol/L溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)加入4mL上述配制的蛋白溶液(注意避光),立即搖勻,在熒光分光光度計(jì)中于390nm激發(fā),470nm檢測發(fā)射熒光強(qiáng)度,用熒光強(qiáng)度對蛋白溶液濃度作圖并進(jìn)行線性回歸,以線性回歸斜率作為表面疏水性的指標(biāo)。

    1.2.2.5 MRPC的分子量分布 采用高壓液相(HPLC)測定MRPC分子量分布:將水解不同時(shí)間的蛋白水解液滅酶,離心,取上清,過0.45μm微孔濾膜,進(jìn)高效凝膠柱Protein KW-803。洗脫液0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0,0.3mol/L NaCl),流速1mL/min,紫外檢測波長280nm。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同蛋白酶對RPC增溶效率

    如圖1所示,Trypsin和Alcalase在反應(yīng)初期和反應(yīng)5h結(jié)束時(shí),RPC溶出量明顯大于其它三種酶的作用效果。與Alcalase相比,在Trypsin作用下,反應(yīng)初期溶出速率較快(曲線斜率較大);在Alcalase作用下的反應(yīng)末期,溶出速率略大于Trypsin作用下的溶出速率。這種差異可能主要是由于Trypsin酶作用的專一性帶來的,在反應(yīng)初期易被Trypsin作用的敏感鍵(Arg和Lys的羧基參與形成的肽鍵)較多,且其水解產(chǎn)物的末端氨基酸側(cè)鏈帶電荷,因而更容易溶出。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,這類肽鍵大量減少,因此,溶出速率明顯下降。然而Alcalase是一種專一性遠(yuǎn)不如Trypsin的肽鏈內(nèi)切酶,在反應(yīng)末期可能還剩下略多的敏感鍵(不局限于Arg和Lys的羧基參與形成的肽鍵),所以在反應(yīng)末期Alcalase作用下,溶出速率略大(曲線斜率較大)。但是對于為什么反應(yīng)初期Alcalase作用下,溶出速率低于Trypsin作用下的溶出速率的問題,從敏感鍵的角度來看,反應(yīng)初期易被Alcalase作用的敏感鍵的數(shù)量有可能是大于易被Trypsin作用的敏感鍵數(shù)量,分析原因可能如下:蛋白酶法增溶反應(yīng)中,不能排除如下因素——即使有些肽鍵被蛋白酶作用斷裂,但是蛋白質(zhì)仍然可能保持在固相中并不溶出。所以,敏感鍵數(shù)量雖多,卻并不一定導(dǎo)致蛋白溶出速率更大。這也從一定程度上說明水解度(DH)不適合描述液固兩相反應(yīng)進(jìn)行的程度。為了工藝上能合理地控制這一條件下的水解反應(yīng),并確定反應(yīng)的程度,在本研究中采用水解時(shí)間與蛋白溶出量關(guān)系來描述反應(yīng)進(jìn)程。

    圖1 不同蛋白酶的增溶效率

    綜合考慮生產(chǎn)成本的因素,Alcalase增溶效率較高且價(jià)格比Trypsin便宜,從工業(yè)應(yīng)用的角度選擇Alcalase更為有利。

    2.2 MRPC的溶解性

    圖2所示,經(jīng)過短時(shí)間Alcalase處理后的RPC,呈現(xiàn)典型的U型溶解曲線,隨著時(shí)間增加,U形的谷底緩慢消失,最后變?yōu)樵诓煌膒H下廣泛可溶。圖3表明等電點(diǎn)溶解性隨酶解時(shí)間增加而增加,在反應(yīng)最初10min時(shí)等電點(diǎn)溶解性增加較為顯著。隨著反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行至60min,等電點(diǎn)溶解性幾乎達(dá)到最高。綜上可知,僅從RPC增溶程度來看,水解60min可達(dá)到提高溶解性的基本要求,不需要水解300min,這樣可以降低生產(chǎn)成本。

    測定經(jīng)過60min水解的RPC氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%,可見RPC改性后溶解性得到較大的提高(改性前NSI低于0.5%),是一種有應(yīng)用潛力的食品蛋白添加劑。

    2.3 MRPC的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

    由圖4可見,隨著水解時(shí)間的增大,乳化活性先增大后減小,然后又略有增大,在維持較長一段時(shí)間的平衡后,在水解300min時(shí)乳化活性顯著增大。與之相反的是,乳化穩(wěn)定性先減小后增大,隨后再減小后增大,在水解300min時(shí)乳化穩(wěn)定性最小。值得注意的是,乳化活性的峰頂正好對應(yīng)乳化穩(wěn)定性的峰谷,而乳化活性的峰谷正好對應(yīng)乳化穩(wěn)定性的峰頂。這一對應(yīng)關(guān)系較好地說明良好的乳化活性劑未必同時(shí)是良好的乳化穩(wěn)定劑。這是因?yàn)榫哂辛己萌榛钚缘奈镔|(zhì)應(yīng)該能快速地?cái)U(kuò)散到界面上,相應(yīng)在界面上不會太穩(wěn)定。而具有良好乳化穩(wěn)定性的物質(zhì),可能在界面上形成一層比較穩(wěn)定的膜,因此雖然難以快速地?cái)U(kuò)散并鋪展至界面(乳化活性差),但是乳化穩(wěn)定性較好。

    圖2 水解時(shí)間對RPC溶解性的影響

    圖3 MRPC等電點(diǎn)溶解性

    圖4 MRPC乳化性和乳化穩(wěn)定性與水解時(shí)間的關(guān)系

    表1 改性RPC與大豆分離蛋白界面特性的比較a

    與大豆分離蛋白對比發(fā)現(xiàn):在水解60min時(shí),雖然MRPC乳化活性與乳化穩(wěn)定性較大豆蛋白略低,這可能與RPC溶解性較低有關(guān);但是仍然不失為一種有開發(fā)潛力的廉價(jià)的食品乳化劑。

    2.4 MRPC的表面疏水性

    圖5為MRPC的表面疏水性與水解時(shí)間的關(guān)系,總的看來,表面疏水性隨著水解的進(jìn)行呈下降趨勢,但是水解10min后表面疏水性基本不再變化。水解60min時(shí)的表面疏水性為2627.6。因此,可以使用蛋白酶水解的方式在一定程度上減小表面疏水性,提高溶解度。

    圖5 RPC表面疏水性與水解時(shí)間的關(guān)系

    2.5 改性后上清液中RPC的分子量分布

    如圖6所示,隨水解時(shí)間增加,MRPC分子量分布有較明顯的變化,總的趨勢是高分子量部分減少,低分子量部分增大。未水解時(shí)(水解0min),根據(jù)分子篩分離蛋白原則,分子量分布基本上可分為三個(gè)部分,分別為:F1(極高分子量組分)、F3(中等分子量組分)、F4(低分子量組分);水解最初(2min)時(shí),F(xiàn)1消失,同時(shí)增加了一個(gè)較為明顯的F2(高分子量組分)部分,這很可能是F1以及不溶性RPC的水解產(chǎn)物;隨著水解的進(jìn)一步進(jìn)行,F(xiàn)2減少,相應(yīng)的F3增加;水解至60min時(shí),F(xiàn)2減少較多,F(xiàn)4部分有所增加;最后在水解至300min時(shí),F(xiàn)3和F4兩個(gè)部分為水解產(chǎn)物的主要部分。表2說明隨著水解的進(jìn)行,F(xiàn)2部分先增加后減少;F3呈先減少后增加的趨勢;F4部分隨水解時(shí)間的增加不斷增加。

    圖6 不同水解時(shí)間改性后上清液中RPC分子量分布

    表2 不同水解時(shí)間各部分水解產(chǎn)物的相對含量

    3 結(jié)論

    利用Alcalase在最適條件下,即底物濃度5%、酶與底物比例0.8%、pH8.5、55℃,改性大米濃縮蛋白(RPC),得到產(chǎn)品MRPC氮溶性指數(shù)(NSI)為52.9%,乳化活性(EA)為0.101,乳化穩(wěn)定性(ES,%)為26.7%,與大豆分離蛋白接近;Alcalase作用可以降低大米濃縮蛋白的表面疏水性,同時(shí)改進(jìn)蛋白產(chǎn)品的分子量分布。如果結(jié)合其它改性方法,如高壓均質(zhì)及化學(xué)改性等方法,可以進(jìn)一步提高RPC的溶解性;對MRPC的水解產(chǎn)物進(jìn)一步利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián),可以改善RPC分子表面親水/疏水微區(qū)分布,提高乳化活性和乳化穩(wěn)定性。總之,改性大米濃縮蛋白(RPC)是一種具有開發(fā)潛力的功能性食品蛋白質(zhì)添加劑。

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    [11]黃友如.醇洗豆粕對大豆分離蛋白的提取及其功能性質(zhì)的影響[D].無錫:江南大學(xué),2003:40-41.

    Enzymatic modification of rice protein concentrate and functional properties of the hydrolysates

    LIU Ji,TANG Jun-ni*
    (School of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

    A potential food protein additive of rice protein concentrate(RPC),was modified by Alcalase at the optimal conditions(concentration of substrate 5%,the ratio of enzyme to substrate 0.8%,pH 8.5,55℃)to improve its functionality in food system.Our research revealed that the functionalities of RPC,including nitrogen solubility index(NSI=52.9%),emulsifying activity(EA=0.101),emulsifying stability(ES=26.7%),surface hydrophobicity (2627.6)and distribution of molecule weight,were promoted by Alcalase hydrolysis and the application of MRPC was extended.

    rice protein concentrate(RPC);Alcalase;modification;functionality

    TS210.1

    A

    1002-0306(2011)08-0206-04

    雖然大米蛋白的營養(yǎng)價(jià)值高于小麥蛋白質(zhì)[1],但是由于大米中蛋白含量較低(6%~9%),且主要是溶解性較差的谷蛋白和醇溶蛋白,因此從大米中直接提取米濃縮蛋白和分離蛋白成本太高,且蛋白產(chǎn)品的功能性質(zhì)也較差,無商業(yè)價(jià)值。研究證實(shí),從米淀粉深加工的副產(chǎn)物米渣中制備大米濃縮或分離蛋白(純度達(dá)90%),具有經(jīng)濟(jì)可行性[2-8],但是由于米蛋白在淀粉高溫液化工藝過程中,受到長時(shí)間的熱處理,溶解性能顯著降低。為了進(jìn)一步提高從米渣中制備RPC在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍,應(yīng)對其進(jìn)行改性。酶反應(yīng)動力學(xué)研究表明,RPC在Alcalase作用下遵守液固兩相反應(yīng)的動力學(xué)。堿性蛋白酶(Alcalase)降解不溶性蛋白組分可能符合“Zipper Reaction”模型[9]。因此,用水解度(DH)表征水解反應(yīng)進(jìn)程受到限制。為了更好地控制這一條件下的水解反應(yīng),并確定反應(yīng)的程度,在本研究中采用水解時(shí)間與蛋白溶出量的關(guān)系來描述反應(yīng)進(jìn)程。本研究針對從米淀粉深加工副產(chǎn)物中制備的RPC為原料,進(jìn)行蛋白酶法改性,并對改性產(chǎn)品功能性質(zhì)進(jìn)行評價(jià),研究高效廉價(jià)的改性方法,為進(jìn)一步拓寬大米蛋白應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    2010-08-02 *通訊聯(lián)系人

    劉驥(1978-),男,碩士,講師,研究方向:食品資源開發(fā)與利用。

    國家自然基金項(xiàng)目(31071515);西南民族大學(xué)中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(09NZYZJ04)。

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