花生種子中凝集素的凝集活性及性質(zhì)研究

孫 杰，呂敬軍，陸豐升，楊慶利，*，畢 潔，張初署，于麗娜，朱 鳳

(1.山東省花生研究所，山東青島266100;2.臨沂市農(nóng)業(yè)委員會，山東臨沂276000; 3.沂水縣農(nóng)業(yè)局，山東沂水276400)

花生種子中凝集素的凝集活性及性質(zhì)研究

孫 杰1，呂敬軍2，陸豐升3，楊慶利1，*，畢 潔1，張初署1，于麗娜1，朱 鳳1

(1.山東省花生研究所，山東青島266100;2.臨沂市農(nóng)業(yè)委員會，山東臨沂276000; 3.沂水縣農(nóng)業(yè)局，山東沂水276400)

利用血凝實驗及糖抑制實驗測定花生種子中凝集素的凝血活性及糖抑制專一性，同時進行熱穩(wěn)定性及pH影響實驗。結(jié)果顯示:花生種子的凝集素粗提液不能凝集人的A、B、O型血細(xì)胞，但是可以凝聚唾液酸酶處理后的A、B、O型血細(xì)胞。凝集素對紅細(xì)胞的凝集可被乳糖、蜜二糖、棉籽糖和D-半乳糖四種糖所抑制，在pH為5.0～11.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，經(jīng)55℃保溫10min后，活性完全消失。在檢測的6個不同品種的花生中，河北高油的種子中凝集素活性最強。在花生的生長初期，這種凝集素的存在部位是子葉和根。

花生，凝集素，凝集反應(yīng)，性質(zhì)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花生種子 花育12號，收于山東省花生研究所實驗站;人的A、B、O型血樣 青島市401醫(yī)院檢驗科提供;唾液酸酶(Neuraminidase N2876) 購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生種子凝集素粗提液的制備 將花生種子去皮。稱取5g去皮的花生種子，用電動研磨器磨碎。稱取研磨后的花生粉3g，以1g∶30mL的比例加入石油醚，在30℃條件下，搖床脫脂5h。將脫脂后的液體抽濾，將濾渣放在培養(yǎng)皿中，在通風(fēng)櫥中晾干。晾干后每種樣品加入30mL PBS，攪拌后放入4℃冰箱過夜。10000r/min離心20min，棄沉淀。上清液中加入固體硫酸銨至60%飽和度，4℃下攪拌2h，10000r/min離心20min，棄上清。沉淀溶于PBS，并用PBS透析過夜，離心除去少量雜質(zhì)，上清即為花生種子凝集素粗提液。

1.2.2 凝集實驗用紅細(xì)胞的制備 人的A、B、O型血樣全血，用3.8%(M/M)枸櫞酸鈉溶液抗凝，各抗凝血經(jīng)2000r/min離心10min除去血漿，加10倍體積的PBS溶液充分洗滌，然后經(jīng)1000r/min離心3min去上清液，重復(fù)4次，最后經(jīng)2500r/min離心3min，配成2%(V/V)的PBS-紅細(xì)胞懸浮液備用。

1.2.3 紅細(xì)胞的唾液酸酶處理 每10mL紅細(xì)胞懸液加入2mg唾液酸酶，37℃處理1h，再以PBS溶液洗滌三次，懸浮為2%～3%的紅細(xì)胞懸液備用。

1.2.4 血凝實驗 取血凝板一塊，用微量移液器向各孔加入 PBS 25μL，向第一排每孔加血清樣品25μL，做倍比稀釋，然后逐行分別加入25μL唾液酸酶處理后的人O型紅血球的2%懸液，在微型振蕩器上振搖2min，室溫下靜置30min后觀察結(jié)果。以能產(chǎn)生凝集的凝集素最大稀釋度的倒數(shù)作為此凝集素的效價。每種血細(xì)胞的血凝實驗重復(fù)三次。

1.2.5 糖溶液的配制 將半乳糖、乳糖、蜜二糖、葡萄糖、木糖、棉籽糖、蔗糖分別溶于PBS緩沖液中，配制成200mmol/L的糖溶液。

1.2.6 抑凝實驗 取血凝板一塊，用微量移液器向各孔加入 PBS 25μL，向第一排每孔加粗提樣品25μL，做倍比稀釋;然后再向第一行每孔中加入25μL PBS作為對照，向其它各行分別逐孔加入25μL給定濃度的各種糖溶液，在微型振蕩器上振搖2min，室溫下靜置30min后，向各孔中加入25μL唾液酸酶處理后的人O型紅血球2%～3%懸液，在微型振蕩器上振搖2min，室溫下靜置30min后觀察結(jié)果，糖的結(jié)合能力以凝集活力效價的減少為標(biāo)準(zhǔn)，即是否能抑制凝集素與紅血球的結(jié)合為標(biāo)準(zhǔn)。每種糖溶液的抑凝實驗重復(fù)三次。

1.2.7 熱穩(wěn)定性測定 將花生種子凝集素粗提樣品分別在溫度為30、40、50、55、60、70、75℃的恒溫水浴中處理10min，測定各樣品的凝集活力。

1.2.8 pH穩(wěn)定性測定 在測定pH對花生種子中凝集素的凝集活性影響時，使用下列緩沖液:pH為4.0～6.0的HAc-NaAc緩沖液;pH為7.0～9.0的Tris-HCl緩沖液;pH為10.0～11.0的Gly-NaOH緩沖液。將凝集素粗提樣品的pH調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在4℃密封的容器中放置1h，然后將各溶液的pH調(diào)至7.4，測定各樣品的凝集活力。

1.2.9 不同品種花生中凝集素活力測定 將豫花15、河北高油、魯花12、F18、耐寒1號和SPI0566種花生種子去皮。稱取5g去皮的花生種子，用電動研磨器磨碎。稱取研磨后的花生粉3g，按1.2.1所述的方法獲得不同品種的凝集素粗提液。按照1.2.4所述方法分別測量6種凝集素粗提液的血凝指數(shù)。

1.2.10 不同組織中凝集素的分布 選取魯花12的種子10粒，在人工培養(yǎng)箱中栽種，培養(yǎng)條件為白天10h，26℃，夜晚14h，22℃，至三葉期。分別去根、莖、葉和子葉，液氮研磨后，以PBS溶解，10000r/min離心20min，棄沉淀。按照1.2.4所述方法檢測上清液的血凝活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生種子凝集素凝集效價的測定

分別測定了唾液酸酶處理之前和之后的人A、B、O型血細(xì)胞對花生種子凝集素的血凝活性，結(jié)果見表1。花生種子中凝集素對于沒經(jīng)過處理的各種血細(xì)胞沒有凝集活性;對唾液酸酶處理后的A、B、O型血細(xì)胞都具有較強的凝集特性，其中對唾液酸酶處理后的O型血的凝集活性最強。凝集素最大的特點是能促使細(xì)胞凝集，比較直觀的表現(xiàn)是使紅血球凝集，但來源不同的凝集素能凝集的紅血球也不一樣。而所有這些作用都與凝集素最重要的性質(zhì)——糖結(jié)合性有關(guān)。例如，王慶忠等［18］報道，豌豆(Pisum setivum L)，蕓豆(Passels vulgaris)，黑豆(Dumasia cordifolia L)，黃豆(Glycine Inax)均可以凝集人的A、B、O型血細(xì)胞，豇豆(Vigna sinnsis)不能凝集人的血細(xì)胞，但是可以凝集家兔和雞的血細(xì)胞。不同血細(xì)胞表面的糖類是不同的，不同種類的凝集素的糖類結(jié)合特性不一樣，因此能夠識別不同種類的血細(xì)胞?；ㄉN子中的凝集素不能結(jié)合未處理的人的血細(xì)胞;但是用唾液酸酶將血細(xì)胞表面多糖中的唾液酸酶解后，花生種子中的凝集素就可以結(jié)合人的A、B、O型血細(xì)胞表面所暴露出的多糖，而且對處理后的O型血細(xì)胞凝集活性最強。這可能是三種血細(xì)胞表面的細(xì)微差異造成的。

表1 花生種子凝集素對人的血細(xì)胞的血凝指數(shù)

表2 各種糖類對花生種子凝集素與處理后人的O型血細(xì)胞凝集的抑凝結(jié)果

表3 花生種子凝集素在不同pH下的凝集活性

表4 花生種子凝集素在不同溫度下的凝集活性

2.2 花生種子凝集素特異結(jié)合的糖類的測定

植物凝集素是一類具有高度特異性糖結(jié)合活性的蛋白，這是它們區(qū)別于所有其它植物蛋白的標(biāo)志。植物凝集素之所以引起人們的廣泛興趣與它們可特異結(jié)合糖類的性質(zhì)密切相關(guān)。植物凝集素特異結(jié)合的糖類很多，目前所知的表面糖類幾乎都可以為某種凝集素所識別。實驗中所選的11種糖中只有棉籽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖有抑凝作用。說明花生凝集素分子中有這些糖的特異性結(jié)合位點，而且花生凝集素多專一作用于外源(即非植物起源)多糖，見表2。不同的凝集素其特異結(jié)合的糖類可能是不同的，這是由凝集素的糖類結(jié)合區(qū)域——糖識別結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate recognition domain，CRD)的結(jié)構(gòu)決定的。例如，蕓豆、白沙豆、赤豆凝集作用可被蔗糖完全抑制，豌豆活性可以被果糖、黑豆活性可以被乳糖、黃豆活性被乳糖和蔗糖部分抑制［18］。說明這幾種植物的糖識別結(jié)構(gòu)域是存在差別的。

2.3 pH和溫度穩(wěn)定性的測定

經(jīng)不同條件下血凝實驗證明，花生凝集素最適pH范圍為pH4.0～11.0(表3)，當(dāng)溫度達到55℃時，花生凝集素的血凝活性消失(表4)。說明花生種子中凝集素比較穩(wěn)定，有廣泛的溫度和pH的適應(yīng)范圍。植物凝集素另一特性是它的穩(wěn)定性。許多研究表明，很多植物凝集素都可以在通常使細(xì)胞內(nèi)蛋白失活的條件下和很大的pH范圍內(nèi)保持活性和穩(wěn)定，對很多蛋白酶不敏感且耐高溫。它們中的大多數(shù)不會被動物或昆蟲胃腸的蛋白酶降解，在很大的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，比其它蛋白如胞內(nèi)酶更具熱穩(wěn)定性;還有一些凝集素甚至是完全穩(wěn)定的蛋白，例如，從刺蕈麻根莖中分離出的凝集素在5%三氯乙酸和0.1N的NaOH中保持穩(wěn)定，沸煮也不會失活，所有通常使用的蛋白酶對它都不起作用［19］。

2.4 不同品種花生中凝集素活力的測定

由圖1可知，本實驗選用的6個花生品種中都存在凝集活性物質(zhì)，各凝集素都對唾液酸酶處理后的人血細(xì)胞顯示了凝集活性。粗提液中2號河北高油和3號魯花12的凝集活性最強，其它品種的凝集活性相似。這六個品種中只有河北高油種子中凝集素效價較高，其余5種凝集素的凝集效價相差不大。可見，不同花生中的凝集素的活性不同，其凝集素的含量也存在差異。說明由于花生的品種、生長條件的差異，其凝集素的含量也存在差異。

圖1 花生種子凝集素對不同花生品種的凝集活性注:花生品種由1～6分別是:豫花15，河北高油，魯花12，F(xiàn)18，耐寒1號，SPI056。

2.5 不同花生組織中凝集素活力的測定

本實驗選取了三葉期的花生根、莖、葉和子葉四種不同組織檢測血凝活性，結(jié)果見圖2。由圖2可知，子葉中凝集素的血凝活性顯著高于其他三種組織。在莖和葉中沒有血凝活性，說明在花生的生長發(fā)育初期，花生種子中的凝集素主要表達的部位是子葉，其次是根。由此可以推斷，花生種子中的這種凝集素的主要功能可能是作為儲存蛋白或?qū)Υ嫖镔|(zhì)進行包裝、運輸，或兼具有保護種子而免于動物取食的作用。具體的生理功能還有待進一步的實驗驗證。

圖2 不同花生組織中凝集素的凝集活性

3 結(jié)論與討論

通過血細(xì)胞凝集實驗和抑凝實驗證實，花生種子中存在一種凝集素，它對唾液酸酶處理后的人的A、B、O型血細(xì)胞有凝集作用;這種凝集活性能夠被乳糖、半乳糖、棉籽糖等糖類所抑制。它的性質(zhì)比較穩(wěn)定，有廣泛的溫度和pH的適應(yīng)范圍，最適pH為5.0～11.0，當(dāng)溫度超過55℃時，生物活性消失。

關(guān)于花生種子中凝集素相關(guān)性質(zhì)的研究國內(nèi)還未見報道，在其他豆科植物中已經(jīng)有凝集素單體的分離純化的報道。由于凝集素單體對于糖鏈具有更加特異的識別能力，可以作為分子探針或糖專一性探針，研究癌變細(xì)胞膜糖鏈結(jié)構(gòu)和細(xì)胞變異，研究特異細(xì)胞膜受體的分布等。下一步研究將總結(jié)前人的提取和純化方法，探索花生種子中凝血活力較高的花生凝集素單體的純化方法，闡明其性質(zhì)和功能，使其在免疫學(xué)、腫瘤、生殖生理、細(xì)胞生物學(xué)等許多方面得到應(yīng)用。

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Study on properties of lectin in seed of peanut(Arachis hypogaea L.)

SUN Jie1，LV Jing-jun2，LU Feng-sheng3，YANG Qing-li1，*，BI Jie1，ZHANG Chu-shu1，YU Li-na1，ZHU Feng1

(1.Shandong Peanut Research Institute，Qingdao 266100，China;
2.The Agriculture Committee of Linyi City，Linyi 276000，China; 3.Yishui County Bureau of Agriculture，Yishui 276400，China)

Lectin crude extraction from peanut seed were detected for agglutinating activity，glycoinhibiting action and thermostability.The influence of pH on those activities was also tested.The results showed that the lectin crude extraction could not agglutinate three kinds of human erythrocytes.But it showed a strong affinity for human A/B/O erythrocytes(RBC)by neuraminidase treated.Agglutinating activity of crude extraction to neuraminidase treated human O erythrocytes was inhibited by lactose，raffinose，melibiose and D-galactose.The agglutinating activity of peanut seed crude extraction was inhibited at temperatures higher than 55℃ and at a pH less than 5 or greater than 11.The agglutinating activity of Hebei Gaoyou was the strongest in the detected six different peanut cultivars. Cotyledon and root might contain this lectin in seed germination and seedling growth of peanut.

peanut;lectin;agglutinating activity;property

TS201.2

A

1002-0306(2011)08-0134-04

花生(Arachis Hypogaea L.)是世界上五大油料作物之一，約占世界植物油料年產(chǎn)量的14%。目前，全世界有100多個國家種植花生，總產(chǎn)量約3300萬t?；ㄉ俏覈饕挠土虾徒?jīng)濟作物之一，是食用植物油和蛋白質(zhì)的重要來源。自上世紀(jì)90年代以來，我國花生種植面積基本穩(wěn)定在7000萬畝，僅次于印度列世界第二位;總產(chǎn)量約為1500萬t，出口量在65～78萬t之間，在全球花生生產(chǎn)中的地位舉足輕重［1-2］。脂肪和蛋白質(zhì)是花生中的第一和二大營養(yǎng)素。目前我國花生總產(chǎn)55%～60%的花生用于花生油的生產(chǎn)，花生蛋白資源遠(yuǎn)未得到充分利用，這主要是因為我國人民有食用花生油的傳統(tǒng)，因此長期以來一直重視花生油的生產(chǎn)和加工，花生蛋白的研究并不占優(yōu)勢［3-4］。近年來，花生蛋白開始進入人們的視野并逐漸引起重視，對花生蛋白進行深入研究，闡明其性質(zhì)和功能，成為當(dāng)務(wù)之急。植物凝集素是一種含有非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的植物(糖)蛋白質(zhì)［5］。凝集素最早于1888年由俄國的Stillmark最先在植物種子蓖麻籽中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時取名為蓖麻素(ricin)。經(jīng)過數(shù)十年的深入探索，已經(jīng)在凝集素的性質(zhì)、生理功能、基因結(jié)構(gòu)域表達等方面取得了很大的進展［7-8］。凝集素最大的特點是能促使細(xì)胞凝集，比較直觀的表現(xiàn)是使紅血球凝集［6］。凝集素在其所在的機體內(nèi)還有許多生理功能，如細(xì)胞與細(xì)胞間粘著、分子或離子的傳遞、雌蕊受粉、轉(zhuǎn)基因抗蟲［9-10］、共生固氮［11］、防御病原體侵入［12］等。豆科凝集素是來自豆科植物的一類同源蛋白，是目前研究得最為清楚的凝集素家族，已經(jīng)從70多種植物中純化得到了豆科凝集素，其中大部分來自種子，豆科凝集素還存在于葉片、莖、皮、根等營養(yǎng)器官中［13-15］。雖然凝集素的生化活性方面有大量的研究報道，但是，結(jié)構(gòu)和功能研究的比較明確的只有少數(shù)幾種凝集素［16-17］。本文對花生種子中凝集素的基本理化性質(zhì)，糖結(jié)合特點進行了研究，為深入研究花生種子凝集素的性質(zhì)、特點提供了前提，為闡明其生理功能奠定了基礎(chǔ)。

2010-07-22 *通訊聯(lián)系人

孫杰(1981-)，女，博士，助理研究員，從事食品科學(xué)與工程的研究。