毛豆腐的毛霉發(fā)酵與其提取物的體外ACE抑制活性

杭 梅，趙新淮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

毛豆腐的毛霉發(fā)酵與其提取物的體外ACE抑制活性

杭 梅，趙新淮*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

利用分離得到的1株毛霉發(fā)酵豆腐制備毛豆腐。采用20%、40%、60%(v/v)乙醇溶液作為提取溶劑，對發(fā)酵時間為3、5、7、9d的毛豆腐樣品進(jìn)行提取，測定提取物中可溶性蛋白質(zhì)的提取率、水解度，以及提取物的體外ACE抑制活性。研究結(jié)果表明，隨著毛豆腐發(fā)酵時間的延長，提取物中可溶性蛋白質(zhì)提取率、水解度逐漸增加;毛豆腐發(fā)酵第5d時，60%(v/v)乙醇溶液提取物的ACE抑制活性最高，并且其氨基酸組成分析結(jié)果表明，60%(v/v)乙醇溶液提取物中總疏水性氨基酸和脯氨酸的量最多。

毛霉，毛豆腐，乙醇提取物，ACE抑制活性

近年來，人們對具有預(yù)防或治療某些疾病的食品成分產(chǎn)生了興趣［1－2］。大豆發(fā)酵制品具有某些較好的生理功能，諸如抗癌、抗氧化、抗菌和降血壓等［3］。大豆發(fā)酵制品的降血壓功能，主要源于其中所含有的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽，這類肽已從許多大豆制品中提取并被研究［1，4－5］。毛豆腐是我國徽州的著名小吃［6］，是利用微生物發(fā)酵豆腐所制成的發(fā)酵食品，可以有效地提高大豆的消化率和生物價［7］。毛霉是生產(chǎn)毛豆腐的主要菌種。毛霉能分泌蛋白酶，將蛋白質(zhì)分解生成氨基酸和多肽等，使食品具有獨特的風(fēng)味和細(xì)膩的質(zhì)地。毛豆腐的制作工藝與腐乳相似，而關(guān)于腐乳的降血壓功能已有多個研究報告。已有研究者研究日本腐乳和中國腐乳的ACE抑制活性［8－9］。倪莉認(rèn)為，在腐乳的水溶性成分中含有ACE抑制活性肽［10］。我們曾經(jīng)研究過毛豆腐發(fā)酵過程中主要成分、微細(xì)結(jié)構(gòu)等的變化［11］，并確定了毛霉產(chǎn)蛋白酶的適宜發(fā)酵條件［12］，并未評價毛豆腐中蛋白質(zhì)的生物活性，不能確定毛霉發(fā)酵是否能夠使得毛豆腐提取物具有ACE抑制作用。為此，根據(jù)過去的工作基礎(chǔ)，本研究利用以前分離得到的1株毛霉菌種，實驗室發(fā)酵制備毛豆腐樣品，然后利用3種組成比例不同的乙醇水溶液為提取劑，對發(fā)酵時間不同的毛豆腐樣品分別進(jìn)行提取，分析各種提取物中蛋白質(zhì)組分的含量及其水解度大小，然后測定其體外的ACE抑制活性，最后對具有最高活性的提取物進(jìn)行氨基酸組成分析。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

豆腐 購自哈爾濱市市場;毛霉(Mucor) 從民間自然發(fā)酵生產(chǎn)的毛豆腐中分離獲得;兔肺丙酮粉、FAPGG(FA－Phe－Gly－Gly) Sigma公司;其它所用試劑為分析純試劑，所用水為蒸餾水。

UV－2401PC型紫外可見分光光度計 日本島津公司;AL204型分析天平 梅特勒－托利多儀器中國有限公司;Kjeltec TM2300型自動凱氏定氮儀 瑞士Foss公司;DHP－9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器

鎮(zhèn)海金鑫醫(yī)療器械有限公司;H－1型微型漩渦混合器、DS－1高速組織搗碎機(jī) 上海精科實業(yè)有限公司;YH－4BS型遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛豆腐制作 取市售的豆腐，將豆腐切塊為6cm×6cm×4cm大小，121℃滅菌30min后，稍風(fēng)干除去水滴，然后擺放在竹籠內(nèi)，豆腐塊之間應(yīng)保持一定距離，以利于發(fā)酵。

預(yù)先將毛霉制成菌懸液，用毛刷將菌懸液均勻涂于各表面，用紗布將竹籠覆蓋好后送入培養(yǎng)箱。

培養(yǎng)箱溫度控制在20℃。發(fā)酵過程中，豆腐表面出現(xiàn)白色絨毛并形成菌膜;發(fā)酵后期豆腐軟化并有毛豆腐特有的香氣。在發(fā)酵時間為3、5、7、9d時，隨機(jī)取出若干樣品，進(jìn)行提取與分析。

1.2.2 毛豆腐水分與總蛋白質(zhì)的測定

1.2.2.1 水分測定 采用 105℃烘干法［13］。平行3次。

1.2.2.2 總蛋白質(zhì)測定 采用凱氏定氮法［14］。將毛豆腐樣品在121℃滅酶30min，取出冷卻，除去菌膜后用高速組織搗碎機(jī)搗碎。取一定質(zhì)量的樣品進(jìn)行凱氏定氮分析，計算總蛋白質(zhì)含量，換算系數(shù)為5.71。平行3次。

1.2.3 毛豆腐的提取及蛋白質(zhì)提取率測定 取75g毛豆腐，分別與20%、40%、60%(v/v)乙醇溶液混合，定容到250mL，高速組織搗碎機(jī)中12000r/min搗碎1.5min，離心機(jī)中5000r/min離心15min，分離上清液得到毛豆腐提取物。提取物中的乙醇通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，然后定容至原體積。各個提取物和毛豆腐樣品分別進(jìn)行凱氏定氮分析，計算蛋白質(zhì)提取率。平行3次。

1.2.4 提取物的分析方法

1.2.4.1 游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度 蛋白質(zhì)含量測定參照凱氏定氮法［14］。提取物游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度(DH)測定參照OPA法［15－16］。

水解度計算公式如下∶

DH(%)=［提取物游離氨基含量(μmol/mL)/ 5.71×N1(mg/mL)－0.35(mmol/g)］/7.8(mmol/g) ×100%

式中∶5.71，大豆蛋白質(zhì)的換算系數(shù);0.35mmol/g，大豆蛋白質(zhì)的游離氨基含量;7.8mmol/g，大豆蛋白質(zhì)的肽鍵含量;N1，提取物的氮含量，mg/mL。

1.2.4.2 ACE抑制活性 以FAPGG為底物，采用非連續(xù)分光光度法測定樣品的ACE抑制活性［17－18］。

ACE酶液∶稱取50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL預(yù)冷至4℃的硼酸緩沖溶液(pH 8.3，100mmol/L)中，懸液放入4℃恒溫震蕩搖床中提取12h，20000r/min冷凍離心20min，上清液于4℃低溫保存。

FAPGG底物溶液∶將 FAPGG溶于100mmol/L的硼酸緩沖溶液(pH8.3，含300mmol/L的NaCl)，配制成1.6mmol/L的溶液。

ACE抑制活性測定∶500μL FAPGG底物溶液與100μL超純水或提取物混勻，37℃預(yù)熱 2min，加300μL ACE酶液并在37℃反應(yīng)30min，立即加100μL EDTA(100mmol/L)終止反應(yīng);加4000μL超純水稀釋，平行3次。0min樣品的測定，先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。分光光度計340nm處波長分別測體系在0min和30min時的吸光值，計算差值ΔA(ΔA=A0min－A30min)。以單位時間內(nèi)吸光值變化表示ACE酶活力，提取物對ACE酶的抑制程度按下式計算∶

式中∶ΔAc，加入超純水時吸光值在30min內(nèi)的變化;ΔAi，加入提取物時吸光值在30min內(nèi)的變化。

1.2.4.3 氨基酸組成分析 采用氨基酸自動分析儀進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛豆腐發(fā)酵過程中主要成分組成的變化

毛豆腐發(fā)酵過程中，因為水分的自然蒸發(fā)而損失一部分水分(由84.5%降至73.6%)，這樣就導(dǎo)致毛豆腐的蛋白質(zhì)含量隨之增加(由 8.1%增至14.3%)。這些變化趨勢如圖1所示，并與以前的研究結(jié)果［11］一致。

圖1 毛豆腐毛霉發(fā)酵過程中水分與總蛋白質(zhì)含量變化

2.2 毛豆腐提取物的蛋白質(zhì)提取率和水解度

毛豆腐在被毛霉發(fā)酵不同時間后，利用乙醇濃度不同的3種乙醇溶液提取其中的可溶性蛋白質(zhì)組分。所提取出的蛋白質(zhì)組分的提取率和水解度如表1所示。數(shù)據(jù)表明，隨著毛霉發(fā)酵時間的延長，毛豆腐提取物中蛋白質(zhì)的提取率與水解度均呈現(xiàn)增加的趨勢，尤其是蛋白質(zhì)組分的提取率從6.0%以下增加至31%以上。這說明發(fā)酵過程中毛霉所分泌的蛋白酶，充分地降解了豆腐中的大豆蛋白質(zhì);發(fā)酵時間延長，毛霉分泌蛋白酶的水解作用增加，使其水解度增加，同時也增加了其在提取溶劑中的溶解性，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的提取率增加。毛豆腐發(fā)酵9d時，無論采用何種提取溶劑，可溶性蛋白質(zhì)的提取率和水解度均最大。

表1 不同發(fā)酵時間毛豆腐提取物的可溶性蛋白質(zhì)提取率和水解度

表2 不同發(fā)酵時間毛豆腐提取物的ACE抑制活性(%)

提取溶劑中乙醇含量不同(即極性不同)，影響毛豆腐提取物可溶性蛋白質(zhì)的提取率與水解度。60%(v/v)乙醇溶液的極性最低，提取物中的可溶性蛋白質(zhì)最少、提取率最低，但是水解度相對最大。而20%(v/v)乙醇溶液的極性最高，提取物中的可溶性蛋白質(zhì)最多、提取率最高，但是水解度相對最小。另外，發(fā)酵3d后，所有提取物中蛋白質(zhì)組分的水解度在22%以上，說明蛋白質(zhì)組分是大豆蛋白的降解產(chǎn)物肽而非大豆蛋白質(zhì)。

2.3 毛豆腐提取物的ACE抑制活性

對毛豆腐提取物的ACE抑制活性進(jìn)行測定，固定測定樣品的蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/mL，結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)表明，發(fā)酵時間與提取溶劑組成對提取物的ACE抑制活性有影響。在同一發(fā)酵時間，60% (v/v)乙醇溶液提取物的 ACE抑制活性最高，而20%(v/v)乙醇溶液提取物的ACE抑制活性最低;從發(fā)酵時間的影響來看，發(fā)酵第5d時得到的提取物具有最高抑制活性;整體上看，發(fā)酵時間為5d、60% (v/v)乙醇溶液提取物具有最高的ACE抑制活性。這些結(jié)果表明∶豆腐經(jīng)過毛霉發(fā)酵后，其蛋白質(zhì)被降解，生成對ACE具有抑制作用的肽，使得毛豆腐提取物對ACE的抑制作用加強(qiáng)。也就是說，毛霉發(fā)酵可以賦予豆腐以更好的ACE抑制作用。

2.4 發(fā)酵5d的毛豆腐提取物的氨基酸組成

對發(fā)酵5d的毛豆腐提取物的17種氨基酸的摩爾數(shù)百分組成進(jìn)行分析，測定、計算出的結(jié)果如表3所示。從表3中數(shù)據(jù)可以看出，60%(v/v)乙醇溶液提取物的總疏水性氨基酸最多(37.00%)，20%(v/v)乙醇溶液提取物的總疏水性氨基酸最少(32.20%)。另外，60%(v/v)乙醇溶液提取物中的亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸，尤其是脯氨酸，明顯地高于其他提取物。普遍認(rèn)為疏水性氨基酸在ACE抑制肽中起重要作用。Cheung等人發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽的活性主要取決于C端氨基酸，C端氨基酸為芳香族氨基酸和脯氨酸時，其抑制活性較高［19］。另外，Megías等人認(rèn)為，N端為疏水性的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或堿性氨基酸的肽，與ACE的親和力較強(qiáng)，所以其抑制活性較高［20］。這些結(jié)論支持了表3中的數(shù)據(jù)和前述的提取物ACE抑制活性差異，即毛豆腐提取物的脯氨酸含量高、總疏水性氨基酸多，其ACE抑制活性就高。

表3 毛豆腐發(fā)酵第5d時提取物的氨基酸組成(mol，%)

3 結(jié)論

利用1株毛霉對豆腐進(jìn)行發(fā)酵獲得毛豆腐，利用3種乙醇溶液(20%、40%、60%，v/v)對發(fā)酵時間為3、5、7、9d的毛豆腐樣品進(jìn)行提取，獲得可溶性蛋白質(zhì)提取物。分析表明，提取物中可溶性蛋白質(zhì)的提取率、水解度均隨著發(fā)酵時間的增加而增加;60% (v/v)乙醇溶液提取物中的可溶性蛋白質(zhì)最少、提取率最低、水解度最大，20%(v/v)乙醇溶液提取物中的可溶性蛋白質(zhì)最多、提取率最高、水解度最小。同時，發(fā)酵時間與提取溶劑組成對毛豆腐提取物的ACE抑制活性有影響，發(fā)酵時間為5d、60%(v/v)乙醇溶液提取物具有最高的ACE抑制活性，并且氨基酸組成分析結(jié)果顯示，60%(v/v)乙醇提取物的脯氨酸(Pro)、總疏水性氨基酸最多。豆腐經(jīng)過毛霉的發(fā)酵，賦予其更好的ACE抑制作用。

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Fermentation of Mao－tofu by Mucor spp.and ACE－inhibitory activity of its extracts in vitro

HANG Mei，ZHAO Xin－h(huán)uai*
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Commercial tofu was fermented with a strain of Mucor to prepare Mao－tufu.Mao－tofu samples fermented for 3，5，7，9 days were extracted by three ethanol solutions with ethanol contraction of 20%，40%and 60%(v/v)，respectively.The extraction yield and degree of hydrolysis of the soluble protein fractions in the extracts were analyzed.The ACE－inhibitory activity of the extracts was also evaluated in vitro.The results showed that the longer the fermentation time of Mao－tofu samples，the higher extraction yield and degree of hydrolysis of the soluble protein fractions in the extracts.When Mao－tofu sample was fermented for 5 days，its extract of 60%(v/v)ethanol solution showed the highest ACE－inhibitory activity.Meanwhile，the amino acid compositions obtained indicated that the extract of 60%(v/v)ethanol solution had the highest amount of total hydrophobic amino acids and proline.

Mucor spp.;Mao－tofu;ethanol extracts;ACE－inhibitory activity

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0187－04

2011－08－01 *通訊聯(lián)系人

杭梅(1984－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。