PAEs污染下2種基因型菜心根際土壤微生物特征及差異性

曾巧云,莫測輝,蔡全英(.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院,農(nóng)業(yè)部生態(tài)農(nóng)業(yè)重點開放實驗室,廣東 廣州50642；2.暨南大學環(huán)境工程系,廣東 廣州 50632)

PAEs污染下2種基因型菜心根際土壤微生物特征及差異性

曾巧云1,莫測輝2*,蔡全英1(1.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院,農(nóng)業(yè)部生態(tài)農(nóng)業(yè)重點開放實驗室,廣東 廣州510642；2.暨南大學環(huán)境工程系,廣東 廣州 510632)

設(shè)置鄰苯二甲酸酯(PAEs)3個污染水平(T1,T2,T3)和對照處理(T0),盆栽2種基因型菜心(油青60天菜心和特青60天菜心),研究2種菜心不同生長期根際土壤微生物生物量碳氮(Cmic、Nmic)和總體代謝活性(AWCD)的動態(tài)變化特征及差異性,初步揭示2種菜心吸收累積PAEs差異的根際微生態(tài)機理.結(jié)果表明,2種菜心根際土壤 Cmic分別介于 84.45～213.30mg/kg和 98.33～229.85mg/kg,Nmic分別介于9.00～25.86mg/kg和12.69～34.36mg/kg,顯著高于未種植物的處理. AWCD值分別介于0.744～1.075和0.847～1.318,特青60天菜心顯著高于未種植物的處理. 2種基因型菜心相比,特青60天菜心根際土壤Cmic, Nmic以及AWCD值均大于油青60天菜心(T3處理開花期除外),部分處理間差異顯著. 2種基因型菜心莖葉和根系中PAEs含量與Cmic、Nmic和AWCD之間的相關(guān)性均未達到顯著程度,說明2種基因型菜心莖葉和根系中PAEs含量可能與其他因素有關(guān).

鄰苯二甲酸酯(PAEs)；菜心(Brassica parachinensis)；土壤；微生物生物量；微生物功能多樣性

我國一些地區(qū)農(nóng)業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯(PAEs)濃度達到幾個至十幾個 mg/kg,超過了美國有關(guān)土壤控制標準[1-2],對土壤微生態(tài)和植物生長產(chǎn)生不利影響[3-5],而且還可能累積在植物體內(nèi)[6-9],危及農(nóng)產(chǎn)品安全和人類健康.微生物降解是自然環(huán)境中 PAEs完全礦化的主要途徑[10].根系分泌物能為根際微生物的生長提供碳源,因此植物對根際微生物的生長具有一定的促進作用[11].但不同植物類型或同一植物不同基因型根系分泌物存在著差異,直接影響根際微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和代謝功能多樣性[12],以及根際環(huán)境中污染物的生物有效性[13],從而導(dǎo)致污染物被植物吸收累積及被微生物降解的差異性.因此,研究污染條件下不同植物或同一植物不同基因型根際土壤的微生物特性,對明確污染物在土壤-植物系統(tǒng)中的環(huán)境行為具有重要意義.目前關(guān)于PAEs污染下植物對土壤中微生物影響的研究鮮見報道.因此,本研究應(yīng)用已篩選出的PAEs高/低吸收累積基因型菜心(油青 60天菜心和特青 60天菜心)[8-9],以環(huán)境中普遍檢出的2種PAEs化合物(鄰苯二甲酸正二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP))為研究對象,研究 PAEs污染水平下 2種基因型菜心不同生長期根際土壤微生物生物量和代謝功能多樣性的動態(tài)變化及其差異性,初步揭示 2種基因型菜心吸收累積PAEs差異的根際微生態(tài)機理.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物為前期試驗所篩選出的對 PAEs高吸收累積基因型菜心(油青60天菜心,簡稱油青 60)和對 PAEs低吸收累積基因型菜心(特青60天菜心,簡稱特青 60)[8-9],種子購自廣東省農(nóng)業(yè)科學院.

供試化合物DBP和DEHP,為分析純,均購自廣州化學試劑廠.

表1 盆栽前土壤中PAEs化合物的初始含量(mg/kg)Table 1 Initial concentrations of DBP and DEHP in soil(mg/kg)

供試土壤為水稻土,采自華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場,其pH 5.86,有機質(zhì)含量為13.5g/kg,全氮、全磷和全鉀含量分別為1.00g/kg、1.38g/kg和32.16g/kg.土壤經(jīng)自然風干過 5mm 篩后備用.設(shè)置 3個PAEs人工污染水平(即T1,T2,T3,DBP和DEHP的濃度同時分別為20,50,100mg/kg)和對照處理(即T0,土壤中不添加 PAEs),污染土壤的配制參考文獻[8-9].盆栽前土壤中DBP和DEHP的初始含量見表1.

1.2 盆栽與采樣

盆栽試驗在華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院網(wǎng)室中進行.試驗設(shè)置未種植物處理和種植 2種基因型菜心處理,用根墊法(60目不銹鋼絲網(wǎng))區(qū)分根際、非根際土壤,其中根際土壤為 2kg,非根際土為3kg.每個處理重復(fù)6次,隨機區(qū)組排列.盆栽期間用蒸餾水澆灌(以不滲漏為準),人工防治蟲害,不噴施農(nóng)藥.

分別于菜心的幼苗期(播種后第 15d)、葉片生長期(播種后第 25d)、菜苔形成期(播種后第39d)和開花期(播種后第52d)采集根際土壤樣品.根際土壤采集的具體操作為采集不銹鋼絲網(wǎng)以上,菜心根基周圍2cm的土壤,去除根系及其它雜物,置于0～4℃的冰箱備用.

1.3 測定項目與方法

土壤微生物生物量碳(Cmic)和微生物生物量氮(Nmic)的測定采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[14].土壤微生物功能多樣性采用Biolog ECO板進行測定,按照文獻[15]報道的方法:稱取相當于 10g烘干土壤的根際土壤,加入到裝有100mL滅菌生理鹽水(0.85%)的 250mL三角瓶中,在旋渦振蕩器上振蕩1min后置于冰水浴中1min.如此重復(fù)3次.靜置 5min,吸取 5mL上述土壤懸浮液置于裝有45mL滅菌生理鹽水(0.85%)的150mL三角瓶中,搖勻后吸取上述土壤浸提液加入到 Biolog ECO 板,每孔 100μL,分別于 0, 24, 48, 72, 96, 120和144h在Biolog微孔板讀數(shù)儀上測定其吸光值,測定波長為 590nm.土壤微生物代謝剖面的表達采用每孔的平均吸光度值(AWCD),計算式為AWCD值=[∑(C-R)]/95,其中C是所測定的95孔中每孔反應(yīng)的吸光值,R是對照孔的吸光值.

土壤中 PAEs的預(yù)處理采用索氏抽提方法,參考美國環(huán)保署(US EPA) 3540方法,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測方法參考US EPA 8270C方法.具體步驟見文獻[8-9].定量分析用 PAEs(包括DBP和DEHP等6種化合物)、內(nèi)標化合物(菲-d10、芘-d10)和代用品標準物質(zhì)(苯胺-d5)均為色譜純標準物,購自美國 ULTRA Scientific,Inc., North Kingstown; RI..采用標樣的0, 2.5, 5.0,7.5, 10.0μg/mL為工作曲線,內(nèi)標法定量.苯胺-d5的回收率為82.69%～90.25%,DBP和DEHP的檢測限為0.582μg/L和0.491μg/L,空白試驗中未檢測出試驗化合物.

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

實驗數(shù)據(jù)采用 Duncan進行多重比較,所用軟件為SAS 9.1.

2 結(jié)果與分析

2.1 2種基因型菜心不同生長期根際微生物生物量碳的動態(tài)變化特征

Bootstrap 是由 Twitter 的 Mark Otto 和 Jacob Thornton開發(fā)的。Bootstrap 是 2011 年8月在 GitHub 上發(fā)布的開源產(chǎn)品。Bootstrap基于 HTML、CSS、JAVASCRIPT， 用于快速開發(fā) Web 應(yīng)用程序和網(wǎng)站的前端框架。Bootstrap的響應(yīng)式 CSS 能夠自適應(yīng)于臺式機、平板電腦和手機。

未種植物處理、油青60處理和特青60處理根際土壤 Cmic分別介于 47.49～90.82mg/kg、84.45～213.30mg/kg 和 98.33～229.85mg/kg.各PAEs污染水平下2種基因型菜心不同生長期根際土壤Cmic的動態(tài)變化特征見圖1.

各PAEs污染水平下, 2種基因型菜心不同生長期根際土壤Cmic均顯著高于未種植物處理,其中油青 60根際土壤 Cmic是未種植物處理的1.2～2.6倍,特青 60根際土壤 Cmic是未種植物處理的1.5～3.4倍. 2種基因型菜心相比,除T3處理的開花期以外,特青60根際土壤Cmic均大于油青60,前者是后者的 1.1～1.7倍,絕大部分處理間差異顯著.隨著盆栽時間的增加,未種植物處理土壤Cmic值呈現(xiàn)增加的趨勢,其中第 52d顯著高于第15d和第25d; 2種基因型菜心根際土壤Cmic整體上呈先增加后下降(特青60天菜心T1處理除外)的趨勢,且部分處理間差異顯著.

對于未種植物處理, PAEs對 Cmic的影響與土壤PAEs添加濃度和取樣時間有關(guān).第15d時,試驗所設(shè)置的3個PAEs添加濃度對土壤Cmic均具有一定的促進作用,50mg/kg(T2)處理比對照處理(T0)提高了46%,差異顯著;第25d時,試驗所設(shè)置的3個PAEs添加濃度處理土壤Cmic值接近;第39d和52d時,土壤Cmic隨著土壤中PAEs添加濃度的增加而升高, T1,T2,T3比 T0分別提高了15%, 27%, 44% (第 39d)和 18%, 34%, 39% (第52d),差異顯著(第39d的T1除外).

對于油青60,當土壤PAEs添加濃度不超過50mg/kg (T2)時,幼苗期和葉片生長期根際土壤Cmic隨著 PAEs添加濃度的增加而增加,T2比T0分別提高了14% (幼苗期)和42% (葉片生長期),其中葉片生長期差異顯著;當土壤 PAEs添加濃度達到100mg/kg (T3)時,根際土壤Cmic則受到抑制,與T0相比,幼苗期和葉片生期分別下降9%和12%,但差異不顯著.隨著盆栽時間的增加,菜苔形成期根際土壤Cmic則隨著PAEs添加濃度的增加而顯著增加, T1, T2, T3比 T0分別提高了39%,75%和99%.開花期根際土壤Cmic變化復(fù)雜,T1和 T3處理比 T0分別提高了 14%和 30%,差異顯著,而T2則與T0接近.

對于特青60,與油青 60不同,本試驗所設(shè)置的3個PAEs添加濃度在菜心生長幼苗期和葉片生長期并未對根際土壤 Cmic產(chǎn)生抑制作用,其中T2比T0分別提高了47% (幼苗期)和49% (葉片生長期),差異顯著.菜苔形成期根際土壤 Cmic變化與油青60相似,隨著PAEs添加濃度的增加而增加, T2, T3比T0分別提高了25%和39%.開花期根際土壤Cmic與前 3個生長期和油青 60不同,呈現(xiàn) T3＜T0＜T2＜T1,差異顯著,這可能與特青 60 根際土壤中微生物生長周期特性有關(guān).

2.2 2種基因型菜心不同生長期根際微生物生物量氮的動態(tài)變化特征

未種植物處理、油青60處理和特青60處理根際土壤微生物生物量氮(Nmic)分別介于 3.67～7.39mg/kg、9.00～25.86mg/kg 和 12.69～34.36mg/kg.各PAEs污染水平下2種基因型菜心不同生長期根際土壤Nmic的動態(tài)變化特征見圖2.

對于不種植物處理,與 Cmic相似, PAEs對Nmic的影響與土壤PAEs添加濃度和取樣時間有關(guān).當土壤中PAEs添加濃度不超過50mg/kg (T2)時, Nmic在第15d和25d受到一定程度的促進作用,其中第 15d T2顯著高于 T0,提高了 53%.而當土壤中PAEs添加濃度達到100mg/kg時, Nmic在第15d和25d受到一定程度的抑制作用,但差異不顯著.隨著盆栽時間的增加, PAEs高污染水平對土壤中Nmic的抑制作用消失, Nmic在第39d和52d則隨著土壤 PAEs添加濃度的增加而增加,但差異也不顯著.

2種基因型菜心不同生長期根際土壤中Nmic的變化特征與 Cmic相似.對于幼苗期和葉片生長期,當土壤PAEs添加濃度不超過50mg/kg時,油青60根際土壤Nmic隨PAEs添加濃度的增加而增加,T2顯著高于T0,分別提高了24% (幼苗期)和56%(葉片生長期);而特青60根際土壤Nmic隨PAEs濃度的增加而顯著增加,幼苗期T1和T2比T0分別提高了17%和85%,葉片生長期分別提高了13% (T1)和86% (T2).當土壤PAEs添加濃度達到100mg/kg時,油青60根際土壤Nmic受到一定程度的抵制作用,其中幼苗期比T0下降了27%,差異顯著;而特青60幼苗期和葉片生長期根際土壤Nmic分別比T0提高了 30%和 50%,差異顯著.隨著盆栽時間的增加,高濃度 PAEs (100mg/kg)對油青 60根際土壤Nmic的抑制作用消失,菜苔形成期2種基因型菜心根際土壤Nmic均隨PAEs濃度的增加而增加,大部分處理間差異顯著.開花期各PAEs污染2種基因型菜心根際土壤Nmic變化不大,除特青60T1顯著高于T0外,其他處理間差異均不顯著.

2.3 2種基因型菜心不同生長期根際土壤微生物功能多樣性的動態(tài)變化特征

平均顏色變化率(AWCD)作為微生物總體活性的一個重要指標,其值的大小代表了不同處理土壤微生物對底物碳源利用能力上的差異.本實驗采用Biolog微平板培養(yǎng)96h的數(shù)據(jù)來進行微生物總體代謝活性分析.未種植物處理、油青60處理和特青60處理根際土壤AWCD分別介于 0.571～0.891、0.744～1.075 和 0.847～1.318.各PAEs污染水平下2種基因型菜心不同生長期根際土壤AWCD的動態(tài)變化特征見圖3.

與土壤 Cmic和 Nmic相似,各 PAEs污染水平下,不同生長期 2種基因型菜心根際土壤微生物總體代謝活性均大于未種植物處理,其中油青60根際土壤AWCD是未種植物處理的1.1～1.4倍,差異不顯著;特青60根際土壤AWCD是未種植物處理的1.3～1.6倍,差異顯著. 2種基因型菜心相比,特青60根際土壤微生物總體代謝活性高于油青60,前者AWCD值是后者的1.1～1.4倍,其中菜苔形成期差異顯著.

對于未種植物處理,當 PAEs添加濃度為20mg/kg時,土壤AWCD值與T0接近;當PAEs添加濃度達到50mg/kg時,第15d和25d AWCD值下降,其中 T2(50mg/kg)比 T0分別下降 19%(第15d)和11%(第25d),但差異不顯著; T3(100mg/kg)比T0分別下降34%(第15d)和29%(第25d),差異顯著.隨著培養(yǎng)時間的增加, PAEs對土壤微生物總體代謝活性的影響減小,第39d和52d各污染水平間 AWCD 值接近,無顯著差異.這與前人研究結(jié)果相符[3,17],可能與土壤中PAEs對微生物的毒性隨著時間的增加而減弱有關(guān).

PAEs污染對2種基因型菜心根際土壤微生物總體代謝活性的影響與Cmic和Nmic不同.與T0相比, PAEs低污染濃度(20mg/kg,T1)在幼苗期對2種基因型菜心根際土壤AWCD均具有一定的促進作用,但差異不顯著;而當 PAEs添加濃度達到50mg/kg時,幼苗期和葉片生長期對2種基因型菜心根際土壤AWCD均具有一定的抑制作用,其中特青60幼苗期T3比T0下降了24%,差異顯著.隨著盆栽時間的增加,葉片生長期 PAEs高污染濃度(≥50mg/kg,T1)對特青60根際土壤AWCD的影響逐漸減弱,各污染水平下的AWCD值接近;而對油青60根際土壤 AWCD仍具有一定的抑制,T2和T3比T0分別下降了10%和17%,但差異不顯著.開花期 PAEs對根際土壤微生物總體代謝活性的抑制和促進作用減弱,各 PAEs污染水平下的AWCD值接近.

3 討論

有關(guān)PAE污染對土壤微生物影響的研究表明,當土壤DBP濃度小于10mg/kg, DEHP濃度小于20mg/kg時,對土壤Cmic沒有明顯影響;而當濃度達到50mg/kg時,對土壤Cmic表現(xiàn)出抑制效應(yīng),且抑制作用隨處理濃度的增加而加強[3].當DEHP濃度達100mg/kg時,顯著降低了土壤微生物代謝活性[16].本文中,PAEs對 Cmic和當土壤PAEs添加濃度不超過 50mg/kg時,對土壤 Cmic和 Nmic具有一定的刺激作用.當土壤 PAEs添加濃度達到100mg/kg時,對土壤Cmic和Nmic的刺激和抑制作用在幼苗期和葉片生長期并不明顯,但在菜苔形成期和開花期表現(xiàn)為顯著的刺激作用.這與文獻[3]的報道不同.究其原因可能有:其一,試驗條件不同.與文獻[3]的研究所用室內(nèi)恒溫箱相比,本試驗是在通風的網(wǎng)室中進行,可能更有利于PAEs的非生物性損失和生物降解,從而導(dǎo)致2個試驗中土壤PAEs的實際生物有效性可能不同;其二,取樣時間不同.本研究的取樣時間為添加污染物后的第20, 30, 44, 57d,較文獻[3]的取樣時間要遲.而一般來說,培育時間越長,污染物在土壤中的濃度和生物有效性越低,從而對土壤微生物的生態(tài)毒性作用越弱.如,百菌清處理前 3d對土壤微生物活性產(chǎn)生顯著的抑制作用,但7d后逐漸恢復(fù)[17].恩諾沙星對土壤微生物功能多樣性的抑制作用也只維持9d[18].農(nóng)藥對土壤微生物量的影響往往在1個月之內(nèi)就恢復(fù)到原來的水平[19].本實驗中,當土壤PAEs添加濃度為20mg/kg時,土壤微生物代謝活性與T0接近,而當土壤PAEs添加濃度達到50mg/kg時,對土壤微生物代謝活性具有一定的抑制作用,抑制作用的強度隨 PAEs濃度的增加而增加,當土壤 PAEs添加濃度達到100mg/kg時作用顯著.這與文獻[3]和[17]所報道的100mg/kg一致.

種植 2種基因型菜心根際土壤 Cmic、Nmic以及AWCD均高于未種植物處理,與PAEs污染下種植綠豆處理根際土壤中微生物代謝活性高于未種植綠豆處理結(jié)果一致[16],這可能與植物生長過程中根系向生長介質(zhì)分泌有機酸、糖類物質(zhì)和氨基酸等物質(zhì),為土壤微生物的生長提供有利條件[16,20].不同植物甚至是同一植物不同基因型間土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)也存在一定的差異.如,超積累生態(tài)型東南景天根際土壤的微生物生物量碳氮以及微生物對碳源的利用速率和強度等均顯著高于非超積累型東南景天的根際土壤[13].本實驗中,特青60根際土壤Cmic、Nmic以及AWCD均高于油青 60 (T3處理的開花期除外),前者對Cmic、Nmic以及AWCD的促進作用均達到顯著程度,而后者僅顯著提高了根際土壤中Cmic和Nmic,對AWCD的促進作用不顯著.一般來說,土壤中微生物生物量越大,代謝功能多樣性越強,越有利于有機污染物的降解,從而降低植物對有機污染物的吸收和有機污染物在土壤中的殘留.2種基因型菜心莖葉和根系中 PAEs含量與Cmic、Nmic和AWCD之間的相關(guān)性均未達到顯著程度,說明 2種基因型菜心莖葉和根系中 PAEs含量可能與其他因素,如, 2種基因型菜心根系形態(tài)和生理特性[21]、根系解剖結(jié)構(gòu)[22]及根際土壤中 PAEs的生物有效性[23]相關(guān).根系分泌物不僅為根際微生物生長提供所需的能源,影響根際微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)[24-25].根際分泌物還會直接影響根際土壤中有機污染物的生物有效性[26],所以 2種基因型菜心根系分泌物的差異,及其對根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的特異性影響還有待于深入研究.

4 結(jié)論

4.1 兩種基因型菜心根際土壤 Cmic分別為84.45～213.30mg/kg 和 98.33～229.85mg/kg,Nmic分別為 9.00～25.86mg/kg 和 12.69～34.36mg/kg,AWCD 值分別為 0.744～1.075 和 0.847～1.318,均為特青60大于油青60,甚至達到顯著程度.

4.2 兩種基因型菜心根際土壤 PAEs殘留量主要與AWCD有關(guān),但莖葉和根系中PAEs含量與Cmic、Nmic和 AWCD相關(guān)性不顯著,說明這些因素不是導(dǎo)致2種基因型菜心莖葉和根系中PAEs含量顯著差異的主要原因.

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The microbial characteristics and differences in rhizospheric soils contaminated with PAEs grown high/low PAEs accumulation genotypes of Brassica parachinensis.

ZENG Qiao-Yun1, MO Ce-Hui2*, CAI Quan-Ying1(1. Key Laboratory of Ecological Agriculture of Ministry of Agriculture of the People1’s Republic of China, College of Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2.Department of Environmental Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：466～473

Two genotypic cultivars of Brassica parachinensis, Youqing-60 (high PAEs-accumulation) and Teqing-60 (low PAEs-accumulation), were cultivated in the soils spiked with three levels (20, 50 and 100mg/kg) of dibutyl phthalate and di(2-ethylhexyl) phthalate to investigate the microbial biomasses and metabolic activities in rhizospheric soils at four growth stages of Brassica parachinensis. The results showed that the microbial biomass C (Cmic) in rhizospheric soils of Youqing-60 and Teqing-60 ranged from 84.45 to 213.30mg/kg and 98.33 to 229.85mg/kg, and their microbial biomass N(Nmic) varied from 9.00to 25.86mg/kg and 12.69 to 34.36mg/kg, respectively, which were significantly higher than those in soils without plant. Their average well color development (AWCD) values ranged from 0.744 to 1.075 and 0.847 to 1.318, respectively, which of Teqing-60 were significantly higher than those in soils without plant. Moreover, Cmic, Nmicand AWCD in soils grown cultivar Teqing-60 were higher than those of Youqing-60 (except for treatment of T3at flowering stage), and significant differences were observed between some treatments. PAEs concentrations in shoots and roots of two genotypes of Brassica parachinensis were not significantly negatively correlated with Cmic, Nmicand AWCD values, indicating that PAEs concentrations in shoots and roots of two genotypes of Brassica parachinensis may be related to other factors.

phthalic acid esters；Brassica parachinensis；soil；microbial biomass；microbial functional diversity

X503:23

A

1000-6923(2011)03-0466-08

2010-07-19

國家自然科學基金資助項目(30600372,30471007);廣東省科技計劃項目(2010A020507001-73,2010B020311006);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(21610410,21609709);廣東省高校高層次人才項目

* 責任作者, 教授, tchmo@jnu.edu.cn

曾巧云(1974-),女,湖南益陽人,講師,碩士,主要從事環(huán)境有機污染與控制技術(shù)研究工作.發(fā)表論文30余篇.