基于酶固定的新型抗壞血酸傳感器的研究

劉文娟,崔 淼,劉巧玲,王海霞,樊 麗,雙少敏,董 川

（山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西太原030006）

0 引言

L-抗壞血酸(如圖1所示)是一種人體必需的維生素，也是一種抗氧化劑，可提高人體的免疫力及反應(yīng)能力。有研究表明，人體內(nèi)缺乏L-抗壞血酸會導(dǎo)致黃褐斑、牙齦腫脹、粘膜出血等[1]。但是其在人體內(nèi)無法自身合成，所以從食物和藥物中攝取就成為獲取L-抗壞血酸的重要途徑。簡便、快速、準(zhǔn)確地對抗壞血酸進行檢測具有十分重要的意義。傳統(tǒng)抗壞血酸的檢測方法主要有電化學(xué)法[2]、分光光度法[3]及色譜法[4]等。而這些方法選擇性較差、操作復(fù)雜、干擾嚴(yán)重。

以固定化酶為特征的傳感器具有反應(yīng)快、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，是目前研究較多的生物傳感器之一。

圖1 抗壞血酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of L-ascorbic acid

在組裝酶生物傳感器的過程中，酶的固定和穩(wěn)定性是很重要的。許多不同的固體材料可以作為固定化酶的載體，通常，固定化方法主要有物理包埋法、吸附法、化學(xué)交聯(lián)法、共價鍵合法等。由于雞蛋膜使用簡單、透氣性好、及生物兼容性好是酶的優(yōu)良載體，已應(yīng)用于酶的固定化。Wu等[5]，將葡萄糖氧化酶固定于雞蛋膜檢測葡萄糖，靈敏度、穩(wěn)定性等得到了滿意的結(jié)果。Matsumoto等[6]將抗壞血酸氧化酶固定于膠原膜，研制了抗壞血酸生物傳感器，檢測范圍寬，靈敏度高。但是由于固定的酶容易脫落，所以這種抗壞血酸傳感器的使用壽命較短，重現(xiàn)性較差。

該文采用物理包埋和化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合的固定化酶的方法，選取殼聚糖作包埋劑，戊二醛為交聯(lián)劑，將抗壞血酸氧化酶固定在雞蛋膜表面。L-抗壞血酸在抗壞血酸氧化酶(A.O)作用下經(jīng)氧氣氧化生成脫氫抗壞血酸和水。通過氧電極檢測反應(yīng)中消耗氧氣的量來測定抗壞血酸含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Pasco Cl-6542氧電極 (Roseville,CA,USA)，Science Workshop 500 interface數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Pasco Scientific,Roseville,CA,USA)，JB-2型恒溫磁力攪拌器及PHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

抗壞血酸氧化酶 (Sigma，活力為1620 U/mg protein)，L-抗壞血酸 (北京化工廠)， 殼聚糖(Sigma，脫乙酰度為 75%～85%)，戊二醛（天津瑞金特化學(xué)品有限公司，質(zhì)量分數(shù)為50%），Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.1 mol/L)。所有化學(xué)試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 酶電極的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖于燒杯中，加入10 mL 0.05 mol/L HCl溶液，加熱（80～90 ℃）溶解。然后將溶液冷卻至室溫，滴加0.1 mol/L NaOH溶液至pH=5.0，用直徑為35 mm的濾紙過濾得質(zhì)量濃度為0.3%的殼聚糖澄清溶液。稱取2 mg抗壞血酸氧化酶溶于28 μL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液，將制得的酶溶液在4℃下保存。

取一個新鮮的雞蛋殼，小心地剝離蛋膜，用去離子水清洗干凈后將雞蛋膜裁成直徑1.5 cm左右的圓片，依次在膜上滴加5 μL酶溶液和100 μL殼聚糖溶液，數(shù)分鐘后滴加2 μL質(zhì)量分數(shù)為50%的戊二醛，用玻璃棒輕輕地將溶液在雞蛋膜表面攪勻。室溫下放置8 h晾干，置于冰箱中冷藏過夜。 用磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=5.0)沖洗數(shù)次，洗掉未固定的酶，將酶膜緊貼在氧電極的表面，用“O”形圈固定即制得抗壞血酸酶電極。

1.3 測定方法

將制備好的抗壞血酸酶電極浸入5 mL 0.1 mol/L被空氣飽和的磷酸鹽緩沖溶液(pH=5.0)中，在攪拌條件下加入一定量0.1 mol/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液。電極電位變化被輸入計算機的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中，并以溶解氧濃度變化的形式輸出。記錄溶解氧濃度的下降曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定抗壞血酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗壞血酸傳感器的響應(yīng)行為

抗壞血酸氧化酶可選擇性地將抗壞血酸催化氧化成脫氫抗壞血酸，伴隨著溶液中氧氣的消耗，如反應(yīng)式（1）所示，氧電極作為換能器檢測氧氣的消耗量，根據(jù)溶解氧濃度的降低作為傳感器的分析檢測信號?？箟难釢舛鹊倪B續(xù)改變可以在傳感器上產(chǎn)生典型的響應(yīng)曲線，如圖2所示，獲得了抗壞血酸濃度和溶解氧濃度下降值之間的線性關(guān)系，校準(zhǔn)曲線如圖2內(nèi)插圖所示。

2.2 戊二醛作交聯(lián)劑與未使用戊二醛制得酶膜的響應(yīng)信號比較

圖2 抗壞血酸生傳感器對不同濃度的抗壞血酸溶液的響應(yīng)曲線加入 0.10 mol/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為(0)0.0、 (1)1.0、 (2)3.0、 (3)5.0、 (4)7.0、 (5)10.0、 (6)15.0 μLFig.2 Typical response curve of the ascorbic acid biosensor at pH5.0 phosphate buffer(100 mmol/L)after each successive addition of various volume of 0.10 mol/L ascorbic acid standard

取兩個雞蛋膜，膜a以殼聚糖做包埋劑、戊二醛為交聯(lián)劑固定酶，膜b只采用殼聚糖作連接劑固定等量的酶，分別覆蓋于氧電極表面，制備抗壞血酸傳感器。在相同實驗條件下記錄溶解氧濃度下降曲線。從圖3中可看出，相同條件下采用膜a制得的傳感器測得的溶解氧濃度下降值更大，說明戊二醛作為交聯(lián)劑，能夠減少酶的脫落，減少測定誤差。

圖3 戊二醛作交聯(lián)劑與未使用戊二醛制得酶膜的響應(yīng)信號比較Fig.3 Comparison of the performance of two kinds of biosensors with ascorbate oxidase immobilized eggshell with or without glutaraldehyde as cross-linking agent

2.3 溫度的影響

移取5 mL磷酸緩沖溶液置于溫度依次為10、20、30、40、50 ℃的恒溫水浴中，分別加入等量抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄溶解氧濃度下降曲線。結(jié)果表明，隨著溫度升高，溶解氧濃度的下降值增大。說明酶在較高溫度下，能夠獲得較大反應(yīng)活性，使酶促反應(yīng)過程中氧消耗的速率加快，溶解氧濃度的改變信號較大。盡管溫度升高有利于加快酶促反應(yīng)速率，但考慮到長期處于高溫環(huán)境容易使酶失活而減少使用壽命。因此，實驗以室溫作為適宜的溫度。

2.4 溶液pH的影響

在pH為4.0～8.0的磷酸緩沖溶液中，分別加入 25 μL 0.10 mol/L L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄溶解氧濃度下降曲線，結(jié)果顯示，最佳pH為5.0；在 pH 為 4.0～8.0 之間，該傳感器仍可以保持其最佳響應(yīng)值的90%以上。當(dāng)pH值大于7時，響應(yīng)值明顯降低。這可能是由于抗壞血酸的Pka1值為4.17，pH值過高使其脫氫生成較穩(wěn)定的烯醇式結(jié)構(gòu)，而相鄰的雙鍵使得這種結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，同時脫氫抗壞血酸迅速轉(zhuǎn)變成兩種可能的二酮結(jié)構(gòu)。因此實驗中采用pH為5.0的緩沖溶液進行實驗。

2.5 戊二醛的質(zhì)量分數(shù)的影響

以戊二醛的質(zhì)量分數(shù)分別為 2.5%，5.0%，10%，15%，17.5%和20%制作五種類型酶膜，覆蓋于氧電極表面制成不同抗壞血酸傳感器，在相同實驗條件下測定溶解氧濃度的下降值。結(jié)果表明，當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分數(shù)在2.5%～15%范圍內(nèi)，電極響應(yīng)隨著戊二醛的質(zhì)量分數(shù)增加而增大；當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分數(shù)大于15%時，電極響應(yīng)隨戊二醛質(zhì)量分數(shù)增加而明顯減小?？赡艿脑騕5,7]是戊二醛含有細胞毒素，有一定生物毒性，高質(zhì)量分數(shù)戊二醛可能使酶部分失活，而導(dǎo)致傳感器靈敏度下降。因此實驗中采用質(zhì)量分數(shù)為15%的戊二醛為交聯(lián)劑。

2.6 酶固定量的影響

在五個干凈的雞蛋殼膜上，分別滴加含酶量為 2，3，4，5，6，7 Units的酶溶液，制備一系列酶膜，并與溶解氧電極偶聯(lián)制得抗壞血酸生物傳感器。 在 5 mL 磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=5.0)中加入一定量的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄溶解氧濃度下降值（結(jié)果見表1）。從表1可看出：酶固定量在2～6 Units，溶解氧濃度的下降值隨酶量的增加而急劇增大，而當(dāng)酶固定量大于6 Units時增加幅度減小，可能是由于作為交聯(lián)劑的戊二醛用量限制了酶的最大固定量的緣故。所以實驗采用每張膜固定6 Units抗壞血酸氧化酶為最佳酶用量。

表1 酶固定量對傳感器響應(yīng)性能的影響Tab.1 Interference effect of ascorbic acid biosensor

2.7 傳感器分析性能的測定

在 5 mL 磷酸緩沖溶液 （0.10 mol/L pH=5.0）中測定0.50 mmol/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄從加樣到溶解氧濃度達到基本平衡時的值，平均響應(yīng)時間約為80 s。

該傳感器的線性回歸方程為y=4.608 23 x+0.091 17(r2=0.999 0),抗壞血酸濃度在 0.02～0.82 mmol/L之間呈良好的線性關(guān)系（如圖2所示）。以3倍信噪比值計算傳感器的檢測限為12 μmol/L。對0.50 mmol/L的抗壞血酸溶液重復(fù)測定20次，RSD＝3.32%。

以0.5 mmol/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液每隔2～3 d測定傳感器的響應(yīng)情況。將修飾的膜浸泡于磷酸緩沖溶液中置于4℃的冰箱中，待用。約90 d后，取出膜，實驗結(jié)果表明響應(yīng)值降低為初始值的87.6%，表明該傳感器具有良好的使用壽命。

2.8 干擾實驗

該實驗對實際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)是否產(chǎn)生干擾進行了考察，并換算成產(chǎn)生相同的響應(yīng)信號時L-抗壞血酸的含量（表2）。對于含有Vc的實際樣品，可能存在的干擾物有D-葡萄糖、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、D-果糖、淀粉、山梨酸鉀及CaCl2。結(jié)果表明，實際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)對抗壞血酸含量的測定幾乎不產(chǎn)生干擾。

表2 干擾物質(zhì)的影響Tab.2 Effect of potential interferents on the ascorbic acid biosensor

2.9 實際樣品的檢測

采用該文提出的方法對市售的2種維生素C片中的抗壞血酸含量進行檢測，將結(jié)果與碘量法所得結(jié)果作了比較，并進行了回收實驗。結(jié)果（見表3）表明，此生物傳感器法較傳統(tǒng)碘量法更加簡便、快速，可以對維生素C補充劑中的抗壞血酸含量進行準(zhǔn)確、快速的檢測。

表3 實際樣品測定結(jié)果Tab.3 Results of determination of ascorbic acid in real samples

3 結(jié)論

該方法研制的抗壞血酸生物傳感器具有檢測范圍更寬、響應(yīng)時間更短、靈敏度更高，為食品中抗壞血酸的檢測提供了一種快捷、簡便、可靠的新方法。

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