提高嗜酸乳桿菌在豆乳中發(fā)酵性能的研究

呂慧超，熊宇生，劉倫倫，夏延斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，長沙410128）

提高嗜酸乳桿菌在豆乳中發(fā)酵性能的研究

呂慧超，熊宇生，劉倫倫，夏延斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，長沙410128）

測定了嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆乳的單菌產(chǎn)酸曲線與混菌產(chǎn)酸曲線，并采用正交實驗分析了它們對發(fā)酵豆乳的品質(zhì)影響及與單菌發(fā)酵豆乳貯存期質(zhì)量變化的比較。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌是影響酸豆乳質(zhì)量的主要因素，嗜熱鏈球菌次之。按體積分數(shù)為2.2%嗜酸乳桿菌、體積分數(shù)為3.0%保加利亞乳桿菌、體積分數(shù)為1.8%嗜熱鏈球菌配比共同發(fā)酵，可得到組織狀態(tài)、口感風味較好的酸豆乳，克服了單一嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳產(chǎn)酸慢、凝乳時間長、活菌數(shù)不高且貯存期活菌數(shù)下降快的缺陷。

豆乳；嗜酸乳桿菌；發(fā)酵性能

0 引言

豆乳，又稱豆奶，是一種營養(yǎng)豐富的傳統(tǒng)食品，含優(yōu)質(zhì)大豆蛋白、大豆異黃酮、多種維生素和礦物質(zhì)，并且不含膽固醇。但在中國市場上，豆奶產(chǎn)品似乎一直在牛奶和豆?jié){的夾縫中生存[1]。發(fā)酵豆乳是以豆乳為原料，加入少量奶粉或某些可供乳酸菌利用的糖類作為發(fā)酵促進劑，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而生產(chǎn)的酸性豆乳飲料[2]，改善了豆乳風味的同時也為其健康發(fā)展提供了出路。

嗜酸乳桿菌是一種腸道益生菌，被視為“第三代酸乳發(fā)酵劑菌種”[3]。其發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)特性較差，凝乳時間較長，產(chǎn)品口感風味也有一定缺陷[4,5]。我國對嗜酸乳桿菌的研究卻還處在起步階段，與其它乳酸菌的混合發(fā)酵目前研究較少，即使有也僅限于工藝方面的研究。關(guān)于其與其它乳酸菌在豆乳中混合發(fā)酵還沒有深入的研究報道。因此，探索乳酸菌在豆乳中的發(fā)酵性能對設(shè)計豆乳發(fā)酵劑以及制定發(fā)酵工藝甚至產(chǎn)品工藝都是非常重要的。

1 實驗

1.1 材料

大豆；蔗糖；無糖脫脂奶粉；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La），由保健品中分離；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgarious，Lb)；嗜熱鏈球菌（Streptoccous themophilus，St)。

活菌計數(shù)培養(yǎng)基：總菌數(shù)以MRS培養(yǎng)基計數(shù)，嗜酸乳桿菌菌數(shù)以山梨醇-MRS培養(yǎng)基計數(shù)。

豆乳培養(yǎng)基：選豆(挑選表面光澤無霉爛變質(zhì)的大豆)——浸泡(0.25%的Na2CO3和KCl按1︰1，常溫浸泡10 h左右）——磨漿去渣(將浸泡好的大豆用熱水中浸泡10 min，撈出于磨漿機中磨漿，濾渣收取豆?jié){)——均質(zhì)(25 MPa,10 min)——殺菌(121℃，15 min)——室溫冷卻備用制得大豆乳培養(yǎng)基。

脫脂乳培養(yǎng)基按乳粉︰水=1︰8復原，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 評價方法

感官評價：本研究由20個經(jīng)過酸乳感官評價培訓的人組成小組，對酸豆乳按表1進行感官評價；正交實驗中，綜合評分=酸度（30%）+感官評分（40%）+活菌數(shù)評分（30%）。

表1 感官評價分數(shù)

1.2.2 酸度滴定

準確吸取搖勻的待測樣品10 mL，加20 mL蒸餾水混合均勻，滴加2滴酚酞，用濃度為0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定，用消耗的NaOH體積乘以10即得酸度值。

1.2.3 菌種馴化

按豆乳體積分數(shù)為0%，10%，30%，60%，90%，100%逐步增大的方法制備豆乳馴化培養(yǎng)基，將在脫脂乳中活化好的菌種先分別接種于10%馴化培養(yǎng)基中，待其凝乳后再轉(zhuǎn)接入該濃度豆乳中，經(jīng)過幾次馴化直到其凝乳時間縮短至6～8 h，再將其轉(zhuǎn)接至下一濃度豆乳培養(yǎng)基中，如此直到每種菌完全適應(yīng)豆乳環(huán)境的生長。馴化培養(yǎng)過程中，若發(fā)現(xiàn)凝乳時間增長或有乳清析出，及時分離菌種復壯，再進行下一步的馴化。

1.2.4 耐酸實驗

采用MRS液體培養(yǎng)基，用濃度為0.1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值分別為l.0，2.0，3.0，4.0，模擬胃酸環(huán)境。然后接種相同量經(jīng)MRS液活化好的嗜酸乳桿菌菌種，將原液（pH值為6.5）與四組實驗組共同放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，馬上拿出用MRS培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)，72 h后觀察實驗結(jié)果。存活率=lgn1/lgn0·100%，其中l(wèi)gn1為不同pH梯度的活菌數(shù)(對數(shù)值)，lgn0原液中的活菌數(shù)（對數(shù)值）[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌產(chǎn)酸曲線測定

將充分活化的嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌分別以體積比（以下同）為8%的接種量接入豆乳培養(yǎng)基中，每隔2 h測定1次酸度，繪制單菌產(chǎn)酸曲線，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，由于豆乳培養(yǎng)基中含有氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，所以菌種隨發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酸量不斷增加，開始時La產(chǎn)酸速度是最快的，但6 h以后Lb產(chǎn)酸最快且最終產(chǎn)酸量最高，其次是La。St產(chǎn)酸速度最慢，且產(chǎn)酸量最低。實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，La和Lb發(fā)酵豆乳基本無豆腥味及其他異味，且Lb凝乳最快，由此可增大Lb在混合菌種中的比例進行發(fā)酵。

2.2 混菌產(chǎn)酸曲線的測定

以嗜酸乳桿菌為主發(fā)酵菌種，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌為輔發(fā)酵菌種，將充分活化好的3種菌分別以La+Lb,La+Lb+St,La+St混合菌種（均按體積比為1︰1的比例）模式，按體積分數(shù)為8%的接種量接入純豆乳培養(yǎng)基中，于40℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔2 h測定一次酸度，繪制混菌產(chǎn)酸曲線如圖2所示。

圖2 混菌產(chǎn)酸曲線的測定

由圖2可以看出，La+Lb混合發(fā)酵豆乳產(chǎn)酸速度是最快的，且最終酸度在70°T以上，達到了酸奶制品所需酸度要求（通常在70°T-90°T之間）。La+Lb+St產(chǎn)酸速度次之，但兩者相差不大，而La+St產(chǎn)酸最慢且最終酸度遠低于所需酸度要求?？梢奓a與Lb兩者在豆乳中有一定的互生效應(yīng)，其共生機制還有待進一步研究。但考慮到La+Lb+St與其產(chǎn)酸相差不大，且3種菌共同發(fā)酵組織狀態(tài)和氣味都較好，因此選用3種菌共同發(fā)酵。

2.3 馴化前后混菌發(fā)酵產(chǎn)酸曲線測定

將馴化前后的菌種分別按La︰Lb︰St=1︰1︰1的比例，接入（接種量8%）純豆乳錐形瓶培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到實驗培養(yǎng)基中，實驗條件與方法同單菌產(chǎn)酸曲線測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 馴化前后混菌發(fā)酵產(chǎn)酸曲線

由圖3可以看出，未馴化的菌種發(fā)酵豆乳雖然能使其凝乳，但凝乳時間長，且最終酸度低于70°T。由圖比較可以看出，馴化前菌種酸度達到70°T需要20 h，而馴化后的菌種只需12 h左右，即縮短了8 h;凝乳時間也從原來的16 h縮短到了8 h?？梢婑Z化后的菌種比未馴化的菌種產(chǎn)酸速度明顯增快且最終產(chǎn)酸量增加，約增加了21.7%。通過活菌計數(shù)還發(fā)現(xiàn)，各種菌活菌數(shù)均達到108，與未馴化的相比均有一定程度的增加。

2.4 3種菌對發(fā)酵豆乳質(zhì)量影響正交實驗

采用馴化后的菌種，采用k(3 3)正交實驗設(shè)計表（因素水平見表2），在40℃條件下恒溫培養(yǎng)發(fā)酵8 h，然后置于4℃冰箱中冷藏后熟24 h,進行相關(guān)評價與測定。正交實驗結(jié)果如表3所示。菌種優(yōu)選實驗后熟時酸度、乳酸菌數(shù)、感官評分及其綜合評分的極差分析結(jié)果如表4所示。

表2 菌種優(yōu)選實驗因素水平

表3 菌種優(yōu)選實驗正交實驗結(jié)果

表4 極差分析結(jié)果

實驗結(jié)果表明：3種菌發(fā)酵豆乳時，對乳酸菌總菌數(shù)的影響最大的是La，其次是St，三者的影響次序為La＞St＞Lb；對后熟時酸度影響的主要因素是Lb＞La＞St；對感官評分影響最大的是La,Lb次之，最后是St,即La＞Lb＞St,并且隨著A、B因素的增加，有利于風味的提高。3個因素對于酸豆乳綜合評分也就是質(zhì)量影響大小為La＞Lb＞St,即嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌是影響豆乳發(fā)酵的主要因素，在豆乳中發(fā)酵性能較好，而嗜熱鏈球菌次之。

2.5 馴化后的嗜酸乳桿菌耐酸實驗

人體胃酸環(huán)境pH值通常在2以下，但隨食物攝入的稀釋作用可上升至3.5左右。嗜酸乳桿菌進入人體后，首先要抵御胃酸環(huán)境[7]。本實驗設(shè)置了pH值為1～4的MRS液，以模擬胃酸環(huán)境，測得菌種存活率如圖4所示。

由圖4可以看出，在pH值為3和4的環(huán)境中，嗜酸乳桿菌都能保持較高的活菌數(shù)，達到90%以上，而pH值為2時存活率下降到了85%，此時活菌數(shù)量級為107；pH值等于1時存活率更是下降到57.3%，其活菌數(shù)量級也由原液的109降低到105。由此可以看出，pH值越低，活菌數(shù)下降越快。嗜酸乳桿菌能發(fā)揮保健效果的劑量不應(yīng)該低于106mL-1或106g-1，攝入食物后，胃酸環(huán)境通常在2以上，故馴化后的嗜酸乳桿菌能發(fā)揮其保健作用。

2.6 混菌發(fā)酵乳與單菌發(fā)酵品貯存期間質(zhì)量變化

在相同條件下培養(yǎng)La+Lb+St(接種量為La2.2%,Lb3.0%,St1.8%)混菌發(fā)酵豆乳（A)和單純La(接種量為7%)發(fā)酵豆乳（B），待其凝乳后，取出置于4℃冰箱中，每隔兩天取樣進行酸度、活菌總數(shù)測定及感官評價，結(jié)果如表5所示。

圖4 馴化后嗜酸乳桿菌耐酸試驗

表5 最佳組合結(jié)果

2.6.1 感官特征比較

由上表可以看出，隨著貯存時間的延長，酸豆乳的酸度不斷增加，但在正常貯存期內(nèi)不超過100°T，在一定程度上有助于酸豆乳風味的提高。用混合菌種發(fā)酵的酸豆乳比用單一嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳效果好，且發(fā)酵質(zhì)量相對穩(wěn)定。A第8 d開始有乳清析出，B第4 d就開始出現(xiàn)，并且析出量均隨時間的延長而增多。

2.6.2 酸度變化情況

A種酸豆乳第4 d至第8 d是酸度增加最快的時候，第10 d后酸度增加較緩慢。從整體上來看，A酸豆乳酸度上升較B慢，而酸度上升慢更有利于酸豆乳風味的提高和乳酸菌活力的保持，故A種酸豆乳更適合工業(yè)上生產(chǎn)。

2.6.3 活菌數(shù)測定

從表中可以看出，A和B中活菌數(shù)都隨時間的延長而呈下降趨勢，第8 d之后下降得尤為快速，第12天后又趨于平緩，但基本上都有108個數(shù)量級。A中嗜酸乳桿菌數(shù)14 d時存活數(shù)還有0.21×108mL-1，達到了的保健效果劑量。但B中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)明顯下降，且第10 d數(shù)量級已降低到106。故利用3種菌混合發(fā)酵明顯優(yōu)于嗜酸乳桿菌單菌發(fā)酵。

3 結(jié)論

（1）測定了3種菌在酸豆乳中單菌產(chǎn)酸情況和混菌產(chǎn)酸情況，利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵，可提高嗜酸乳桿菌在豆乳中的活菌數(shù)和貯存期菌種活力，并且能夠縮短發(fā)酵時間，提高最終產(chǎn)酸量。

（2）通過正交實驗分析了3種菌對發(fā)酵豆乳質(zhì)量的影響,結(jié)果表明嗜酸乳菌、保加利亞乳桿菌是影響發(fā)酵豆乳質(zhì)量的主要因素，嗜熱鏈球菌次之。

（3）探索出最佳菌種比例La為2.2%，Lb為3.0%，St為1.8%，可得到品質(zhì)較好的發(fā)酵豆乳，且最終活菌數(shù)可達108個數(shù)量級，比單一嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳具有明顯的優(yōu)勢。

[1] 高雪麗，梁保安.酸豆奶的研究現(xiàn)狀及展望[J].農(nóng)產(chǎn)品加工：創(chuàng)新版,2009(12):1-2.

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[3] 孟岳成，姜濤.嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳工藝的研究[J].中國乳品工業(yè)，2008，36(3):1-2.

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[7] 上海第一醫(yī)院主編．人體生理學[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：134-139．

Study on improving the fermentation performance of Lactobacillus acidophilus in soybean milk

LV Hui-chao，XIONG Yu-sheng，LIU Lun-lun，XIA Yan-bin
（College of Food Science and Technology,Hunan Agriculture University,Changsha 410000,China)

In this study,Single curves and the mixed lactic acid bacteria acid production curves of Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus bacteria fermented soybean milk were determined.By using the cross-experimental analysis method,their impact on the quality of fermented soybean milk were studied.Also,the quality changes of mixed bacteria and single-strain fermented soybean milk were compared during storage period.The results shows that Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus are the main factors in fermented soybean milk,followed by Streptococcus thermophilus;In accordance with the proportion of 2.2%Lactobacillus acidophilus,3.0%Lactoba cillusbulgaricusand1.8%Streptococc-us thermophilus to co-ferment soybean milk,we can get organized state and good taste,which overcomes the defects of single Lactobacillus acidophilus in fermented soybean milk that produce acid slowly,curd for a long time,not high number of viable cells and fast-decreasing viable cells during storage period.

soybean milk；Lactobacillus acidophilus；fermentation performance

TS252.54

A

1001-2230（2011）03-0038-04

2010-12-15

呂慧超（1990-），女，本科，研究方向為食品微生物發(fā)酵。通訊作者：夏延斌