牛初乳中sIgA雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

朱洪艷，趙紅宇，周盛華，高學軍

（1.黑龍江康普生物科技有限公司，哈爾濱150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

牛初乳中sIgA雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

朱洪艷1，趙紅宇1，周盛華1，高學軍2

（1.黑龍江康普生物科技有限公司，哈爾濱150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

為定量檢測牛初乳中sIgA，建立雙抗夾心ELISA方法。以牛初乳中的sIgA為抗原，免疫新西蘭白兔，制得抗血清，經(jīng)純化后作為包被抗體；利用簡易過碘酸鈉法對兔抗牛sIgA標記辣根過氧化物酶(HRP)，制得酶標抗體；通過方陣滴定法確定ELISA最佳工作條件；進行特異性、重復性、穩(wěn)定性實驗并且檢測牛初乳粉樣本中的sIgA含量。結(jié)果：成功建立了一種定量檢測牛初乳中sIgA的雙抗夾心ELISA方法。該方法線性范圍：15.625～1 000 μg/L；最低檢測限（LOD）為15.625 μg/L；精密度為：批內(nèi)CV=4.8%；批間CV=6.5%。

ELISA，sIgA，牛初乳

0 引言

sIgA是外分泌液中存在的主要抗體，它具有和人初乳相同的免疫源性，是呼吸道、消化道、泌尿生殖道等抵御病毒、細菌等病原及有害物質(zhì)入侵的第一道免疫屏障。研究發(fā)現(xiàn)sIgA能聚集細菌和病毒形成復合物，而易被黏膜屏障所阻擋或通過糞便、痰液及鞘膜液等分泌作用排出體外，是人體黏膜免疫的主要抗體[1-3]。然而，目前牛初乳類產(chǎn)品國內(nèi)外缺乏必要的檢測方法，此種方法的建立為牛初乳類產(chǎn)品的工業(yè)化開發(fā)與檢測提供一種準確、快速、穩(wěn)定的檢測手段。

1 實驗

1.1 材料

牛sIgA蛋白，兔抗牛sIgA多克隆抗體（自制），可溶型單組份TMB底物溶液，辣根過氧化物酶，牛初乳粉，96孔酶標板（Nunc）；Bovine IgA ELISA Quantitation Kit試劑盒，SeperdexG-25，BCA蛋白濃度測定試劑盒，其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純化學試劑，實驗室用水均為去離子水。

1.2 儀器

酶標儀（BIO﹣RAD680），微量移液器，高速冷凍離心機。

1.3 方法

1.3.1 包被抗體的制備

取4只6～8周齡、雄性、健康新西蘭白兔。分成2組，第一組3只，為被免疫兔，第二組1只設(shè)為陰性對照。采用頸、背部皮下多點注射的方法進行免疫，每只兔每次2 mg（以蛋白量計）牛sIgA蛋白免疫原，每隔15 d免疫1次。第3次免疫后10 d，耳靜脈取血，間接ELISA法檢測兔血清效價，當效價達到1︰10 000時心臟采血，制備抗血清。

抗血清經(jīng)飽和（NH4）2SO4鹽析后，過SeperdexG-25柱除鹽，收集除鹽后的溶液，PEG-6000透析濃縮，濃縮后的溶液即為兔抗牛sIgA抗體，檢測效價后，分裝、-20℃凍存。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測純化后抗體濃度。

1.3.2 酶標抗體的制備

采用簡易過碘酸鈉法[4]對純化的兔抗牛sIgA抗體標記辣根過氧化物酶（HRP），加甘油分裝后，-20℃凍存。

1.3.3 雙抗夾心ELISA方法的建立

以方陣滴定法分別確定包被抗體的最佳稀釋度和工作條件；最適封閉液和作用時間；酶標抗體的最佳稀釋度和作用時間；底物溶液的最佳反應時間。建立ELISA的最佳實驗條件。

1.3.4 標準曲線的建立

以牛sIgA蛋白為標準品，系列稀釋質(zhì)量濃度：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 μg/L，按照已確定的ELISA最佳實驗條件進行檢測，同時設(shè)定樣品稀釋液為陰性對照，TBST為空白對照，平行測定20次。以標準蛋白sIgA的質(zhì)量濃度為自變量，其所對應的OD450nm值平均值減去空白OD450nm值為應變量，利用ELISACalc數(shù)據(jù)分析專用軟件繪制標準曲線。確定標準曲線的最低檢測限和線性范圍。

1.3.5 特異性實驗

選取與待檢蛋白性質(zhì)相近的另外幾種乳蛋白：牛免疫球蛋白G（IgG）、牛免疫球蛋白M(IgM)、乳鐵蛋白（LF）、酪蛋白進行特異性實驗，每種蛋白重復兩個孔，設(shè)置樣品稀釋液為陰性對照，sIgA的最低檢出限為陽性對照。

1.3.6 重復性實驗

隨機抽取14個批次的牛初乳粉樣，同時進行批內(nèi)和批間檢測，批內(nèi)設(shè)兩個平行，批間設(shè)10個平行，設(shè)置陰性對照和空白對照，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.3.7 穩(wěn)定性實驗

包被抗體的破壞性實驗：將已包被的酶標板，置于37℃72 h，取出，以1.1.3建立的程序檢測sIgA標準品溶液（62.5 ng/mL），設(shè)兩個平行，計算所測得的sIgA質(zhì)量濃度占sIgA標準溶液初始質(zhì)量濃度的百分比；酶標抗體的破壞性實驗：1︰3000稀釋酶標抗體后，分成小支，約1 mL/支，置于37℃72 h，取出，按1.1.3建立的ELISA程序?qū)嶒?，檢測sIgA標準品溶液（62.5 μg/L），設(shè)置兩個平行，計算所測得的sIgA質(zhì)量濃度占sIgA標準溶液初始質(zhì)量濃度的百分比。

1.3.8 牛初乳粉樣本的檢測

隨機抽取50個牛初乳粉樣，用建立的ELISA方法（設(shè)為A方法）測定其中的sIgA質(zhì)量濃度，在相同條件下與Bovine IgA ELISA Quantitation Kit試劑盒（設(shè)為B方法）的檢測結(jié)果作對照，用統(tǒng)計學方法分析這兩種方法的符合性。

2 結(jié)果

2.1 抗血清純化前后效價的測定

表1為抗血清純化前后效價對比結(jié)果。由表1可以看出，純化前后血清效價均可以達到1︰10 000以上，采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒檢測純化后抗體質(zhì)量濃度為3 g/L。分裝，凍存，備用。

表1 前后效價對比結(jié)果

2.2 雙抗夾心ELISA最佳實驗條件的確定

方陣滴定法確定的雙抗夾心ELISA的最佳實驗條件為：每孔100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/L包被抗體，37℃1 h包被酶標板；pH 8.0 TBST洗板3次，每次間隔3 min；200 ml每孔1%BSA 37℃0.5 h封閉；洗板3次；加抗原或標準品37℃1 h，每孔100 μL；洗板5次；酶標抗體1︰3000稀釋，每孔100 μL（37℃，1 h）；洗板5次；加TMB底物溶液12 min；濃度為2 mol/L的H2SO4終止反應；酶標儀450 nm（主）及630 nm（輔）的雙波長讀取OD值。

2.3 標準曲線的建立

表2為sIgA ELISA檢測結(jié)果。根據(jù)表2的sIgA ELISA檢測數(shù)據(jù)建立的標準曲線如圖1所示，該曲線為4參數(shù)Logistic擬合；方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；A=2.10897；B=-1.63730；C=371.61047；D=0.04871；r2=0.99689。從結(jié)果可以看出：最低檢測限15.625 μg/L；檢測范圍15.625～1 000 μg/L。

表2 sIgA ELISA檢測

2.4 特異性實驗

表3為特異性實驗結(jié)果。由表3可以看出，陽性O(shè)D450nm值與這4種蛋白的OD450nm值的比值均大于2.0，說明本研究建立的ELISA方法不與這幾種蛋白反應，有較好的特異性。

2.5 重復性實驗

根據(jù)SPSS10.0統(tǒng)計軟件中的隨機單位組設(shè)計資料的S–N–K方差分析方法進行分析：批間比較，F(xiàn)=0.487,P=0.673＞0.05；批內(nèi)比較，F(xiàn)=2.16,P=0.259＞0.05,二者差異均無顯著意義。說明建立的雙抗夾心ELISA方法在批內(nèi)和批間檢測同一樣品時差異不顯著。根據(jù)公式CV=S/X×100%,計算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%?？梢娪迷摲椒z測樣品具有較好的重復性。

表3 特異性實驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性實驗

表4為穩(wěn)定性實驗結(jié)果。由表4可以看出，放置37℃（72 h）后所測sIgA質(zhì)量分數(shù)基本不變，根據(jù)《中國生物制品檢定規(guī)程》:一般37℃72 h破壞，與4℃放置相比較，讀值下降不超過20%，認為其效期在6個月左右。由此可以斷定本實驗具有較好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.7 實際牛初乳粉樣本的檢測

表5為牛初乳粉樣本檢測結(jié)果。分別以A方法和B方法檢測隨機抽取的50個牛初乳粉樣，依據(jù)表5所得數(shù)據(jù)做圖，結(jié)果如圖2所示。進行統(tǒng)計學分析：分別對兩種方法所測數(shù)據(jù)進行F和t檢驗。置信度為95%時F計算＜F表，這兩種檢測方法的精密度無顯著性差異。再進行t檢驗：查t值表，f=48，95%置信度時t計算＜t表，故這兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異。兩種方法的檢出符合率為92%。

表5 牛初乳粉樣本檢測結(jié)果

圖2 A方法與B方法的比較

3 討論

影響ELISA實驗結(jié)果的因素很多，需要加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點。特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在本實驗中每批測試均須用一系列不同質(zhì)量濃度的參考標準品，在相同的條件下制作標準曲線。標準曲線稀釋的最適比例可以直接影響到檢測樣本中sIgA質(zhì)量濃度的最終檢出值，因此選擇標準曲線的最適稀釋比例對于定量檢測非常重要[10]。本研究所測的sIgA屬于大分子量物質(zhì)，故選擇的標準曲線范圍較寬，曲線最高點的吸光度接近2.0。以檢測物的質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各質(zhì)量濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。所以最后所確定的標準品的最適稀釋比例應落在這個區(qū)域中?；谝陨显?，本研究最后確定的最佳稀釋質(zhì)量濃度為1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 μg/L。

目前國內(nèi)還沒有定量檢測牛初乳中sIgA的標準方法，本研究選擇雙抗夾心ELISA作為檢測牛初乳中sIgA的方法。該方法簡單、快速、靈敏性高、有較好的重復性、結(jié)果判斷較客觀。為檢測工業(yè)產(chǎn)品中sIgA的含量提供了參考。

[1] 楊致邦.初乳sIgA研究進展[M].國外醫(yī)學：流行病學，傳染病學分冊,2004,31（3）:188-190.

[2] 曹勁松,王曉琴.牛初乳功能性食品的開發(fā)現(xiàn)狀和前景[J].食品科學,1999（5）:14-17.

[3] 高麗霞,郭愛萍.牛初乳中的活性成分及其開發(fā)利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學刊,2010（4）:46-57.

[4] 周惠珍,龔志木,喬伯英,等.辣根過氧化物酶標記葡萄球菌A蛋白的簡易過碘酸鈉法[J].中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院學報,1984,04:171-173.

[5] 項開合.牛乳鐵蛋白單克隆抗體的制備及雙抗夾心ELISA方法的建立[D].吉林:吉林大學,2007.

[6] ZHANG S H,LI L S,OU Y X,et al.Use of Monoclonal Antibodies in Detection of Clostridium botulinum Type B Toxin by ELISA[J].Journal of Medical Colleges of PLA.1986（03）:246-252.

[7] 桑卓奇.ABC-ELISA定量測定紅細胞趨化因子受體及其意義[J].黑龍江醫(yī)學,2007,31（6）:504-604.

[8] 劉麗萍,孫麗洲.定量檢測ProMBP雙抗體夾心方法的建立[J].南京醫(yī)科大學學報,2008,28（7）:836-840.

[9] 張志強,何萍.雙抗體夾心ELISA定量檢測血清Cap43蛋白方法的建立與評價[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2007,17（13）:1561-1564.

[10] 白雪.牛朊蛋白雙抗夾心ELISA方法的建立[D].吉林:吉林大學,2008.

Establishment of a sandwich ELISA for quantitive measurement of sIgA

ZHU Hong-yan1,ZHAO Hong-yu1,ZHOU Sheng-hua1,GAO Xue-jun2
1.Heilongjiang Kanpure biotechnology Co.Ltd.，Harbin 150000；2.Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China）

To establish an effective ELISA mathod for the determination of bovine colostrum sIgA.Rabbit was immunized by bovine colostrum sIgA to obtain the antiserum.Useing the purified antiserum as coating antibody.All the anti-sIgA were labeled with horseradish peroxidase by sodium oxidation method,and take the HRP labeled anti-sIgA for labeled antibody.The optimal concentrations of ELISA were defined by titration.For speciticity reproducibility and sensitivity experiment and measured the sIgA levels of bovine colostrum with this assay.Results a sandwich ELISA assay for detecting sIgA in bovine colostrum was established successfully.The assay result was linear over a concentration range of 15.625～1 000 μg/L with a limit of detection(LOD)of 15.625 μg/L.The coefficients of variation was 4.8%within assay and 6.5%between assay.

ELISA，sIgA，measurement

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0050-03

2010-11-08

朱洪艷（1983-），女，本科，主要從事蛋白純化研究。通訊作者：趙紅宇