嬰兒配方粉中克雷伯氏菌的檢出及污染情況

盧雁，王瑤，于寧，王淼，房玉國，王旻

（1.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,哈爾濱150086;2.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100086；3.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150086）

嬰兒配方粉中克雷伯氏菌的檢出及污染情況

盧雁1，王瑤2，于寧3，王淼1，房玉國1，王旻1

（1.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,哈爾濱150086;2.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100086；3.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150086）

對嬰兒配方粉中腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行篩查，檢出嬰兒配方粉中污染了肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌，檢測樣本241份，污染幾率分別為5.0%和2.5%。所采用的檢驗方法為VRBGA結(jié)合MIAC進(jìn)行分離，采用API20E和VITEC2進(jìn)行生化鑒定。

嬰幼兒配方粉；肺炎克雷伯氏菌；產(chǎn)酸克雷伯氏菌

0 引言

在流行病學(xué)和微生物學(xué)上都有證據(jù)表明，被污染的嬰兒奶粉是嬰兒患病的傳播媒介和傳染源的被定義為A類致病菌，代表細(xì)菌是阪崎腸桿菌[1]、腸炎沙門氏菌；對嬰兒致病，已從奶粉中檢出，但無論是流行病學(xué)還是微生物學(xué)都不能很明確地表明，被污染的嬰兒奶粉是嬰兒傳染病的傳播媒介和傳染源的被定義為B類致病菌，代表細(xì)菌是肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等[2]。

肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌屬于克雷伯氏菌屬（Klebsiella），是重要的條件致病菌，該菌產(chǎn)生胞外毒性復(fù)合物，有些菌株還可產(chǎn)生腸毒素。易于耐藥[3]。即使生產(chǎn)符合現(xiàn)行衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，嬰兒配方奶粉也不是無菌產(chǎn)品。這就是說，它有時可能含有引發(fā)嚴(yán)重疾病的病原體，生產(chǎn)乳粉的企業(yè)也沒有對此菌進(jìn)行監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菌株：肺炎克雷伯氏菌菌株CMCC46117，產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株ATCC49334。

儀器試劑：微生物實驗室常規(guī)儀器。胰化大豆蛋白瓊脂（TSA）、腸桿菌增菌肉湯（EE）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA），肌醇檸檬酸鹽瓊脂（SCAI），麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂（MIAC）；API20E、VITEC GNI生化鑒定卡。

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的檢測

無菌稱取樣品100，10，1 g各3份，加入已預(yù)熱至44℃分別盛有900，90，9mL滅菌蒸餾水中（定量檢驗）或樣品100 g加入900 mL無菌蒸餾水（定性檢驗），輕輕振搖使其充分溶解，制成1∶10樣品勻液，置36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h[4]。取10 mL加入90 mL EE肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h，取增菌培養(yǎng)物劃線接種VRBGA、SCAI、MIAC，四區(qū)法劃線平板，其中SCAI 36℃±1℃培養(yǎng)48 h，其余36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)獲得單個菌落。同時觀察參考菌株在各平板上菌落形態(tài)，將獲得的單個菌落進(jìn)行生化鑒定。

表1 克雷伯氏菌菌株在不同培養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)

表2 克雷伯氏菌菌株的生化鑒定

圖1 結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂

圖2 肌醇檸檬酸鹽瓊脂

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)和生化鑒定

圖3 麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂

表1為克雷伯氏菌菌株在不同培養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)；表2為克雷伯氏菌菌株的生化鑒定；圖1為結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂；圖2為肌醇檸檬酸鹽瓊脂；圖3為麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂。

肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌在以上各培養(yǎng)基上的形態(tài)特征類似，無法區(qū)分。產(chǎn)酸克雷伯氏菌一般分解色氨酸生成吲哚。該兩種菌均發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖。

篩選克雷伯氏菌，VRBGA平板選擇性較差，所有腸桿菌科細(xì)菌都能生長，菌落呈紫紅色或粉紅色，不易判讀目的菌。在SCAI平板上，典型菌落為黃色、突起、濕潤、邊緣整齊的較大菌落，但有些肺炎克雷伯氏菌會生長不良，可能會出現(xiàn)漏檢。在MIAC培養(yǎng)基上，試驗用克雷伯氏菌均形成濕潤、光滑、邊緣整齊的紅色菌落，典型菌落突起、黏稠，相鄰菌落會發(fā)生融合現(xiàn)象，背面觀察菌落具深紅色心，分離效果較好[5]。MIAC培養(yǎng)基具有很高的靈敏性，克雷伯氏菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，所以梭芐青霉素不抑制克雷伯菌的生長[6]。

菌株確認(rèn)：經(jīng)過API20E確認(rèn)均得到好的鑒定結(jié)果，對懷疑的鑒定結(jié)果再進(jìn)行VITEK生化鑒定。實驗室保留從樣品中分離的野株。

結(jié)果報告：生化鑒定結(jié)果符合肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的生化特征，應(yīng)用MPN表查出每100 g樣品中的MPN值，檢測結(jié)果報告為每100 g樣品中的最近似值（MPN值）。檢索表數(shù)值范圍（最近似值）為0.0036～0.023 g-1[7]。

3 討論

2009年我實驗室對樣品進(jìn)行腸道菌篩查，采用無菌水結(jié)合腸道增菌肉湯增菌，VRBGA結(jié)合顯色培養(yǎng)基分離的方法，發(fā)現(xiàn)目前的嬰兒配方粉已受到不同程度的污染，其中包括坂崎腸桿菌、克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、傷口埃希氏菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌，非脫羧勒菌，其中坂崎腸桿菌為國家標(biāo)準(zhǔn)中嚴(yán)格明示不得檢出的條件致病菌[8]，為A類致病菌，傷口埃希氏菌、陰溝腸桿菌與肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌同為B類致病菌。

Harry等人采用蛋白胨水結(jié)合腸道增菌肉湯增菌，VRBGA平板分離的方法，對35個國家141份嬰兒配方奶粉中腸桿菌科的污染情況進(jìn)行了調(diào)查，其中阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌的污染幾率分別為14.2%，9.2%，2.8%[9]。天津出入境檢驗檢疫局根據(jù)傳統(tǒng)方法對在天津口岸進(jìn)境的100份乳粉進(jìn)行了克雷伯氏菌檢測，這些奶粉分別來自新西蘭、法國、澳大利亞、芬蘭、比利時、美國、丹麥、瑞士和德國等9個國家，其中肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌的污染幾率分別為4.0%和1.0%。我實驗室根據(jù)傳統(tǒng)方法結(jié)合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]，檢測樣本241份，其中阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌的污染幾率分別為1.7%，5.0%，2.5%。

這些條件致病菌在配方粉中早已被檢出，克雷伯菌屬細(xì)菌在自然界中廣泛存在于土、水、谷物和人體腸道、呼吸道內(nèi)，本屬中的肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌對成人、嬰幼兒致病性較強，特別是免疫力低下的人群將造成非常嚴(yán)重的后果，可引起支氣管炎、肺炎、化膿性炎癥、泌尿系統(tǒng)和創(chuàng)傷感染，甚至敗血癥、腦膜炎、腹膜炎及食物中毒等疾病[11-12]。

由于該菌55℃（30 min）就能被殺死，產(chǎn)品如被污染，不應(yīng)在生產(chǎn)加工的前段工藝中，應(yīng)為殺菌后產(chǎn)品的二次污染。由于此次檢測發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌監(jiān)測檢出率較低，而克雷伯氏菌監(jiān)測檢出率較高，說明乳制品企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境不是對產(chǎn)品的微生物污染的唯一途徑，可能還存在其他影響因素。由于克雷伯氏菌正常存在于人和動物的腸道中，如排除環(huán)境因素影響，產(chǎn)品如污染該菌屬可能與環(huán)境中的工作人員有關(guān)，應(yīng)當(dāng)引起乳品加工企業(yè)的重視。

腸桿菌科細(xì)菌分布廣泛，在干燥環(huán)境中比較常見，且容易檢測。腸桿菌可作為生產(chǎn)過程及環(huán)境衛(wèi)生狀況的指標(biāo)菌。很容易理解，腸桿菌科陰性的樣品可以規(guī)避很多風(fēng)險，沙門氏菌和阪崎腸桿菌為A類致病菌，是主要的目標(biāo)微生物，所以可將腸桿菌作為衛(wèi)生指標(biāo)，對腸桿菌科的阪崎腸桿菌等條件致病菌實施有效管理，方可發(fā)現(xiàn)被忽視的輕度或間斷性污染。這樣才能更好的控制嬰兒配方奶粉的質(zhì)量，以保障特殊群體的哺喂安全。

[1] FARMER J J,ASBURY M A,HICKMAN F M,et al.Enterobacter Sakazakii:A New Species of“Enterobacteriaceae”Isolated from Clinical Specimens[J].J Syst Bacteriol,1980,30:569-584.

[2] CDC(USA),Enterobacter sakazkii infections associated with the use of powder infant formula Tennessee,2001[J].JAMA,2002,287(17):2004-2005.

[3] 徐海圣,舒妙安.中華鱉肺炎克雷伯氏菌病的病原研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版,2002,11:702-706.

[4] 高虹,張霞,羅茂凰.乳粉中克雷伯菌檢測方法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006,12(16):1480-1482.

[5] 高虹,張霞,關(guān)淳.一種克雷伯氏菌分離培養(yǎng)基的研制[J].食品科學(xué),2008,29(3).

[6] LIVERMORE D M.β一lactamasesin la Boratorya Ndc Linicalre Sistance[J].Cl in Microbiol Rev,1995,8(4);557-584.

[7] SN/T 1632.1-2005.奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法：第1部分[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[8] 劉秀梅,裴曉燕,郭云昌.中國安徽阜陽劣質(zhì)嬰兒配方粉中阪崎腸桿菌的污染[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2004,17(1):10-12.

[9] MUYTJENS H L,ROELOFS W H,JASPAR C H.Quality of powdered Substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae[J].J Clin Microbiol,1988,26(4):743-746.

[10] SN/T 1962-2007.食品中克雷伯氏菌檢測方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[11] CHIU C H,SU L H,W U T L,et al.Liver Abscess Caused by Klebsiella Pneumoniae in Siblings[J].J Clin Microbiol,20 01,39(6);2351-2353.

[12] BONADIO W A.Kiebsiella Pneumoniae Bacteremia in Children.Fifty——Seven Cases in 10 years[J].Am J Dis Child,19 89,143(9):1061-1063.

Detection and contamination about Klebsiella pneumoniae in the infant Formula Pouder

LU Yan1,WANG Yao2,YU Ning3,WANG Miao1,FANG Yu-guo1,WANG Min1
(1.National Dairy Testing Centre,Northeast Agricultural University,harbin 150086,China;2.College of Life Sciences,Tsinghua University,Beijing,100086 China;3.National research centre of dairy engineering and technology,harbin 150086,China)

Through the traditional separation methods for bacteria of Enterobacteriaceae of the infant formula,we found that it had been contaminated Klebsiella pneumoniae,Klebsiella oxytoca in 241 samples,the contaminated ratio is 5.0%,2.5%.The detection method is with the selective medium of VRBGA and MIAC and the identification testing is the API20E biochemistry testing and VITEC2 identification system.

infant formula；Klebsiella..pneumoniae；Klebsiella..oxytoca

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0056-03

2010-07-22

盧雁(1979-),女,工程師,從事食品微生物學(xué)的檢驗與研究。