HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原的比較

金 光，王 衛(wèi)，叢 喆，蔣 虹，陳 霆，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原的比較

金 光，王 衛(wèi)，叢 喆，蔣 虹，陳 霆，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 由于檢測(cè)SIV p27抗原試劑盒來(lái)源困難，有時(shí)不穩(wěn)定，鑒于HIV-1 p24與SIVp27有較強(qiáng)的交叉抗原，本研究比較HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原得出的結(jié)果是否存在一定的相關(guān)性。方法 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒定性和定量檢測(cè)樣品中SIV p27抗原，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回歸和相關(guān)分析。結(jié)果 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原的靈敏度分別是150 pg/mL和62.5 pg/mL。兩種試劑盒檢測(cè)病毒液和血漿中SIV p27抗原的定性結(jié)果一致。定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析得出病毒液的直線回歸決定系數(shù)R2=0.857，直線相關(guān)系數(shù)r=0.926，P＜0.01，直線正相關(guān)程度較高;血漿的直線回歸決定系數(shù)R2=0.512，直線相關(guān)系數(shù)r=0.716，P＜0.05，直線正相關(guān)程度較低。結(jié)論 HIV-1 p24 ELISA試劑盒能夠替代SIV p27 ELISA試劑盒定性檢測(cè)病毒液和血漿中SIV p27抗原，但只能定量檢測(cè)病毒液中SIV p27抗原。

HIV-1 p24;SIV p27

HIV-1 p24抗原和SIV p27抗原分別是HIV-1和SIV的gag基因編碼的高度保守的衣殼蛋白，是HIV-1和SIV的特異性抗原，但兩者在血清學(xué)上存在一定程度的交叉反應(yīng)。目前艾滋病研究中通常使用HIV-1 p24試劑盒檢測(cè)HIV-1 p24抗原和SIV p27試劑盒檢測(cè)HIV-2及SIV p27抗原［1-5］。雖然也有使用HIV-1 p24試劑盒檢測(cè)細(xì)胞感染上清中SIV p27抗原報(bào)道［6］，這樣可以縮短實(shí)驗(yàn)周期和降低實(shí)驗(yàn)成本，但尚無(wú)研究表明兩種ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系和這種替代使用的可行性。因此本研究從兩種衣殼蛋白在血清學(xué)上的交叉反應(yīng)出發(fā)，比較兩種試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原的結(jié)果的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 病毒株

SIVmac239、SHIV-1157ipd3N4、SHIV-KB9、RTSHIV和SHIVSF162p3通過(guò)感染中國(guó)恒河猴外周血單核淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，收集感染上清后0.2 μm濾膜過(guò)濾，-80℃保存。

1.2 血漿

上述病毒株感染中國(guó)恒河猴后，在不同時(shí)間采集EDTA抗凝血，分離血漿，-80℃保存。

1.3 血漿病毒RNA載量的測(cè)定

TRIzol法提取 EDTA抗凝血漿中病毒 RNA，使用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定血漿病毒RNA載量，檢出的最低值為103copies/mL［7］。

1.4 HIV-1 p24 ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原

試劑盒 VironostikaHIV-1antigenmicroelisa systemV9(BioMerieux)平衡至室溫，每孔加入25 μL裂解液后加入100 μL陰性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，37℃孵育60 min，洗板 6次，每孔加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，37℃孵育60 min，洗板6次，加入底物后室溫避光孵育30 min，終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀讀取吸光度值(檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)630 nm)。根據(jù)得到的吸光度值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中SIV p27抗原的濃度。陰性對(duì)照吸光度值+0.07作為臨界值，當(dāng)吸光度值大于臨界值時(shí)判定為陽(yáng)性，小于臨界值時(shí)判定為陰性。

1.5 SIV p27 ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原

試劑盒SIV p27 antigen ELISA(ZeptoMetrix Corporation)平衡至室溫，每孔加入25 μL裂解液后加入200 μL陰性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，37℃孵育2 h或過(guò)夜，洗板6次，每孔加入100 μL生物素連接的多克隆抗體，37℃孵育60 min，洗板6次，每孔加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白，37℃孵育 30 min，洗板 6次，加入底物后室溫避光孵育30 min，終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀讀取吸光度值(檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm)。根據(jù)得到的吸光度值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中SIV p27抗原的濃度。陰性對(duì)照吸光度值+0.05作為臨界值，當(dāng)吸光度值大于臨界值時(shí)判定為陽(yáng)性，小于臨界值時(shí)判定為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行回歸和相關(guān)分析［5］。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1 p24 ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原的靈敏度

HIV-1 p24試劑盒定性檢測(cè)SIV p27抗原的最低檢出濃度為200 pg/mL，定量檢測(cè)的最低檢出濃度為150 pg/mL，更低濃度的抗原判定為陰性或不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。另外，當(dāng)SIV p27抗原濃度大于等于20 000 pg/mL時(shí)，酶標(biāo)儀讀取的吸光度值達(dá)到最大值(3.700)，即 HIV-1 p24試劑盒檢測(cè) SIV p27抗原的濃度范圍是150 pg/mL到20 000 pg/mL?！?”表示定性檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，“-”表示定性檢測(cè)結(jié)果為陰性(表1)。

2.2 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒定性檢測(cè)SIV p27抗原

兩種試劑盒3次定性檢測(cè)的結(jié)果一致，病毒液隨著稀釋倍數(shù)的升高，逐漸變?yōu)殛幮?。RT-SHIV病毒原液中SIV p27抗原濃度最高而SHIV-KB9病毒原液中濃度最低，這與幾株病毒血漿病毒RNA載量的關(guān)系相符。上述幾株病毒液中SHIVSF162p3和 SHIV-KB9為 B亞型，SHIV-1157ipd3N4為C亞型，而除 SHIV-KB9為 CCR5和 CXCR4雙嗜性外，其他都為CCR5嗜性。病毒嗜性的亞型的差異對(duì)SIV p27抗原的檢測(cè)無(wú)明顯影響?！?”表示定性檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，“-”表示定性檢測(cè)結(jié)果為陰性(表2)。兩種ELISA試劑盒三次定性檢測(cè)不同病毒株感染的血漿中SIV p27抗原的結(jié)果一致，血漿病毒RNA載量在5.16×106copies/mL到1.85×108copies/mL范圍內(nèi)的樣品都為陽(yáng)性，而血漿病毒RNA載量小于1.19×106copies/mL的樣品都為陰性。“+”表示定性檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，“-”表示定性檢測(cè)結(jié)果為陰性(表3)。

2.3 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒定量檢測(cè)SIV p27抗原

RT-SHIV病毒液中 SIV p27抗原濃度較高，其他幾株病毒液中濃度較低，兩種試劑盒定量檢測(cè)病毒液中SIV p27抗原濃度的高低呈對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖1)，但血漿中SIV p27抗原濃度的高低并沒(méi)有呈現(xiàn)出這種對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖2)。

使用SPSS 17.0對(duì)SIV p27和HIV-1 p24兩種試劑盒得出的SIV p27抗原檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回歸分析表明，病毒液：Y=0.031X+0.069，R2=0.859，P ＜0.01;血漿：Y=0.023X，R2=0.512，P ＜0.05(X 代表p27，Y代表 p24)。相關(guān)分析表明，病毒液 r=0.926**，P ＜0.01，**表示在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);血漿 r=0.716*，P ＜0.05，*表示在 0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。即兩種試劑盒定量檢測(cè)病毒液和血漿中SIV p27抗原的結(jié)果呈直線正相關(guān)，病毒液呈直線正相關(guān)程度較高，血漿的直線正相關(guān)程度較低(圖3)。

表1 HIV-1 p24 ELISA試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原標(biāo)準(zhǔn)品Tab.1 Detection of SIV p27 antigen standard by HIV-1 p24 ELISA kit

表2 SIV p27試劑盒和 HIV-1 p24試劑盒定性檢測(cè)病毒液中SIV p27抗原Tab.2 The results of qualitative detection of SIV p27 antigen in the virus stocks by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

表3 HIV-1 p24 ELISA試劑盒和SIV p27 ELISA試劑盒定性檢測(cè)血漿中SIV p27抗原Tab.3 The results of qualitative detection of SIV p27 antigen in the plasma by HIV-1 p24 ELISA kit and SIV p27 ELISA kit

3 討論

雖然HIV-1和HIV-2的基因同源性只有55%～60%，但在血清學(xué)反應(yīng)中，Gag和 Pol蛋白上仍存在一定程度的交叉反應(yīng);同時(shí)SIVmac和HIV-2的基因同源性接近90%，血清學(xué)上也存在一定程度的交叉反應(yīng)。實(shí)際上，HIV-1很可能就是由其他靈長(zhǎng)類(lèi)傳播到人類(lèi)的［8，9］。由此可以推斷 HIV-1和 SIV的gag區(qū)編碼的衣殼蛋白之間在血清學(xué)上可能存在一定程度的交叉反應(yīng)。本研究結(jié)果表明確實(shí)存在這種交叉反應(yīng)，HIV-1 p24試劑盒能夠檢測(cè)SIV p27抗原，雖然特異性上不如SIV p27試劑盒且靈敏度也略低，檢出的抗原濃度值有一定程度下降，但這種下降有著良好的相關(guān)性，并未改變樣品性質(zhì)，而這種替代卻可以縮短實(shí)驗(yàn)周期和降低實(shí)驗(yàn)成本。

圖1 HIV-1 p24和SIV p27兩種試劑盒定量檢測(cè)病毒液中的SIV p27抗原Fig.1 Quantitative detection of SIV p27 antigen in the virus stock by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

圖2 HIV-1 p24和SIV p27兩種試劑盒定量檢測(cè)血漿中的SIV p27抗原Fig.2 Quantitative detection of SIV p27 antigen in the plasma by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

圖3 HIV-1 p24和SIV p27兩種試劑盒定量檢測(cè)病毒液和血漿中SIV p27抗原結(jié)果的相關(guān)性Fig.3 Correlation between the results of quantitative detection of SIV p27 antigen in the virus stock and plasma by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

本研究使用HIV-1 p24試劑盒檢測(cè)不同濃度的SIV p27抗原標(biāo)準(zhǔn)品以確定其檢測(cè)范圍和靈敏度。定性檢測(cè)時(shí)，當(dāng) SIV p27抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度小于200 pg/mL時(shí)，不能判定為陽(yáng)性結(jié)果;定量檢測(cè)時(shí)，當(dāng)SIV p27抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度小于150 pg/mL時(shí)，不能檢出。另外，當(dāng) SIV p27抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度大于等于20 000 pg/mL時(shí)，讀取的吸光度值達(dá)到最大值。即HIV-1 p24試劑盒檢測(cè)SIV p27抗原的濃度范圍是150 pg/mL到20 000 pg/mL。此外，本研究使用HIV-1 p24試劑盒檢測(cè)有限的幾個(gè)血漿樣品得出的SIV p27抗原濃度范圍為0.006到0.029 ng/mL，而使用SIV p27試劑盒得出的范圍為0.06到2.5 ng/mL。而有報(bào)道說(shuō)從 SIVmac感染的血漿中檢出的SIV p27抗原濃度范圍為0.5到7 ng/mL。

兩種試劑盒對(duì)病毒液和血漿的定性檢測(cè)結(jié)果完全一致;而對(duì)病毒液和血漿的定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行直線回歸和直線相關(guān)分析表明，病毒液直線正相關(guān)程度較高而血漿直線正相關(guān)程度較低。很顯然血漿中存在一定的干擾因素影響了特異性抗原與抗體的結(jié)合，但這種影響并不大，不足以影響樣品性質(zhì)的判定，但確實(shí)降低了抗原定量檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。與病毒液相比，血漿中含有多種蛋白成份，容易導(dǎo)致非特異性的背景而影響定量檢測(cè)結(jié)果。另外，由于血漿樣品取自不同的中國(guó)恒河猴，個(gè)體間的差異和不同采樣時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物狀態(tài)差異也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。本研究選擇了幾種在艾滋病研究中廣泛使用的毒株及其感染血漿進(jìn)行檢測(cè)，雖然幾種毒株的亞型和嗜性不同，但這些毒株都是在SIVmac239克隆株的基礎(chǔ)上直接或間接構(gòu)建得到的，構(gòu)建過(guò)程中大多數(shù)只是對(duì)env基因進(jìn)行替換而沒(méi)有改變gag和pol保守區(qū)，因此這幾株病毒表達(dá)相似的SIV p27核心抗原，這使得我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，也可能是病毒液的定量檢測(cè)結(jié)果具有較高相關(guān)性的原因，反之也表明毒株的亞型和嗜性的差異不會(huì)影響定量檢測(cè)的結(jié)果。

值得一提的是，病毒RNA載量的高低與HIV-1 p24或SIV p27抗原的檢出也有一定相關(guān)性。有研究表明當(dāng)病毒RNA載量在105copies/mL以上時(shí)，HIV-1 p24試劑盒才能檢出293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中SIV p27抗原，且 SIV p27抗原濃度與病毒 RNA載量相關(guān)性很好(R2=0.834，P ＜ 0.001)［6］。也有研究表明SIVagm感染的非洲綠猴的血漿病毒RNA載量在107到108copies/mL時(shí)能夠檢出約5 ng/mL的SIV p27抗原，血漿病毒 RNA載量在105copies/mL以下時(shí)不能檢出 SIV p27抗原。還有結(jié)果表明，SIVagm感染的非洲綠猴血漿病毒RNA載量在大于2×105copies/mL時(shí)才能檢出 SIV p27抗原。我們使用兩種試劑盒都只能檢出血漿病毒RNA載量在106copies/mL以上的樣品中的 SIV p27抗原，而這樣高的病毒RNA載量只會(huì)在感染的急性感染期內(nèi)一過(guò)性出現(xiàn)。由于每個(gè)HIV-1或SIV病毒顆粒都含有主要由p24或p27抗原組成的衣殼及殼內(nèi)包裝的兩個(gè)RNA單鏈，這種結(jié)構(gòu)是血漿病毒RNA載量與特異性抗原之間的相關(guān)性的基礎(chǔ)。因此，可以進(jìn)一步研究?jī)煞N試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與病毒RNA載量之間的相關(guān)性。

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Comparison of the Efficacy of HIV-1 p24 ELISA Kit and SIV p27 ELISA Kit in Detection of SIV p27 Antigen

JIN Guang，WANG Wei，CONG Zhe，JIANG Hong，CHENG Ting，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective The ELISA kit for HIV-1 p24 is sometimes used for SIV p27 detection.The aim of this study was to eclarify whether there is any dependence and correlation between the results of detecting SIV p27 antigen by HIV-1 p24 ELISA kit and SIV p27 ELISA kit.Methods SIV p27 antigens were detected qualitatively and quantitatively by HIV-1 p24 ELISA kit and SIV p27 ELISA kit，respectively，and the results were compared by regression and correlation analysis.Results The sensitivity of detecting SIV p27 antigen was 150 pg/mL by HIV-1 p24 ELISA kit while 62.5 pg/mL by SIV p27 ELISA kit.The qualitative results obtained by HIV-1 p24 kit consisted with those by SIV p27 kit on detecting SIV p27 antigen in virus stock and plasma.The statistical analysis of quantitative results indicated linear regression R2=0.857，linear correlation r=0.926，P ＜ 0.01 in virus stock，while R2=0.512，r=0.716，P＜0.05 in plasma.The quantitative results turned out to be positive linear regression，which was higher in virus stock and lower inplasma.Conclusions HIV-1 p24 ELISA kit can be used for detecting SIV p27 antigen in virus stock and plasma qualitatively replacing SIV p27 ELISA kit，but quantitatively was appropriate in virus stock only.

HIV-1 p24;SIV p27;Detection;ELISA kit

R33

A

1671-7856(2011)02-0026-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.07

2010-09-29

“十一五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)課題 (2009ZX10004-402，2009ZX10004-307)。

金光，男，碩士研究生，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)研究工作。

魏強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。