動態(tài)濁度法定量檢測毛冬青注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素

廣東省韶關(guān)市藥品檢驗所（512024）王莉蓓 陳華龍 嚴(yán)曉明 姜麗君

筆者通過動態(tài)濁度法定量檢測毛冬青注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，建立毛冬青注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析的方法。

1 材料與儀器

毛冬青注射液（批號：090101、090106、090908，規(guī)格：2ml/支，含毛冬青提取物40mg，廣東省博羅先鋒藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；動態(tài)濁度鱟試劑（批號0807252，1.25 ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號：150601－200861，150/支，中國藥品生物制品檢定所）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號：0809080，5ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀（天津大學(xué)無線電廠）（檢測光源405nm）；ZH-2型漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。METTLER TOLEDOsevenEasy pH酸度計（梅特勒）；UV-2550型紫外分光光度計（島津）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 按細(xì)菌內(nèi)毒素限值公式L=K/M，K為人用每kg體重每1h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，非放射性注射劑的K值為5.0 Eu/kg·h，M為1h內(nèi)每kg體重最大給藥劑量。毛冬青注射液用量一次2ml，其L值為L=K/M＝5/2/60＝150Eu/ml。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及可靠性[2]用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解稀釋，使其最終內(nèi)毒素濃度分別為5.0，1.0，0.2，0.04Eu/ml稀釋系列。各取0.2ml分別加到預(yù)先加有0.1ml動態(tài)濁度鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測，其中每一濃度做2支平行管，并同時做2支陰性對照管（NC）。結(jié)果見附表1。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為 lgT=2.7465±0.22252lgC，r=0.9931，|r|>0.980。標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)λ1＝0.04 Eu/ml，陰性對照內(nèi)毒素均小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

附表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗

2.3 干擾實驗

2.3.1 供試品最大稀釋倍數(shù)計算[2]按公式MVD=L·C/λ，毛冬青注射液的L＝150Eu/ml，C為1.0ml/ml，選取0.04～5.0Eu/ml的范圍測試。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度λ1為0.04Eu/ml，其最大稀釋倍數(shù)均為MVD＝150·1.0/0.04＝3750

2.3.2 供試品溶液配制及干擾預(yù)實驗 將毛冬青注射液（批號090101），用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200等比系列稀釋液，作為供試品空白管（Et）。同時另分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2λ（λ為中點(diǎn)濃度0.5Eu/ml）和供試品各等比系列的2倍濃度稀釋液，在稀釋用試管中等量混合，得到在此稀釋倍數(shù)下含λm內(nèi)毒素的供試品溶液，作為供試品陽性管（Es）。分別取上述溶液各0.2ml加入預(yù)先加有0.1ml動態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測，其中每一濃度做2支平行管，并同時做2支陰性對照管（NC），2支陽性對照管（PC），計算回收率?；厥章剩?）=Es－Et/λ×100%，結(jié)果見附表2、附表3。

從附表2、3中可見，供試品等比稀釋液中，1∶200，1∶400，1∶800，稀釋液的回收率分別為513%、352%、96%。稀釋液1:1600，1：3200，稀釋液的回收率分別為107%和85%。1：1600，1：3200的回收率均在50%～200%，符合《中國藥典》規(guī)定。在日常檢查中，選1：3200稀釋液。

附表2 毛冬青注射液預(yù)干擾實驗結(jié)果

附表3 毛冬青注射液預(yù)干擾實驗結(jié)果

2.4 定量檢查 根據(jù)以上預(yù)干擾實驗結(jié)果，對3批毛冬青注射液以1：3200稀釋液進(jìn)行定量檢查。見附表4。

2.4.1 干擾影響的試驗 毛冬青注射液在日常檢查中其回收率要在有效范圍時，其稀釋倍數(shù)為1：3200。而供試品對檢測光源的吸收及pH值對試驗有一定影響。對檢測光源的吸收試驗：檢測光源的波長為405nm。毛冬青注射液（批號批號：090101）用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成本次實驗系列濃度，用島津UV-2550型紫外分光光度計定點(diǎn)405nm波長處測定吸收值。pH值試驗：毛冬青注射液（批號批號：090101）原液及本次實驗系列濃度，結(jié)果見附表5。

附表4 毛冬青注射液定量檢查結(jié)果

附表5 毛冬青注射液對檢測光源的吸收試驗及pH值試驗

3 討論

3.1 中藥注射液對對檢測光源有吸收，引起干擾。如毛冬青注射液，在對檢測光源的吸收試驗結(jié)果可見，毛冬青注射液在50～1600倍稀釋液對檢測光源405nm有較大的吸收作用，故光源吸收是主要的干擾原因。建議在做中藥注射液細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法檢測時，根據(jù)其最大稀釋倍數(shù)配成等比系列，首先在檢測光源405nm進(jìn)行檢測，通過對檢測光源的吸收試驗，快速篩選出試驗濃度范圍。

3.2 中藥注射劑成分復(fù)雜，含β－葡聚糖類似內(nèi)毒素物質(zhì)，用動態(tài)濁度法定量檢測時，要觀察反應(yīng)曲線，考察樣品的干擾，可判定是類似內(nèi)毒素物質(zhì)的反應(yīng)，還是供試品自身的內(nèi)毒素反應(yīng)。