NET-1、EGFR在肺癌中的表達(dá)及意義

江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院（224001）卞偉鋼 胡平 宋曙 何嘯 王傳斌 陳萍

南通大學(xué)（226001）陳莉

NET-1(new EST tetraspan numbered 1)是由Serru等[1]于2000年在EST數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的7個新的含四個跨膜區(qū)域蛋白超家族(TM4SF)的成員，是一個腫瘤增殖相關(guān)蛋白，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)、粘附、移動、增生和分化中起重要作用。已有報道，在多種惡性腫瘤中存在NET-1基因的異常表達(dá)[2～4]。表皮生長因子（EGFR）屬于表皮生長因子家族（erbB家族）成員之一[5]，其異常表達(dá)參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤血管生成、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。NET-1與EGFR在肺癌的發(fā)生、惡性進(jìn)展中是否發(fā)生了協(xié)同作用，在國內(nèi)外的研究中尚未見報道。

1 臨床資料

1.1 病例與標(biāo)本 收集2004年1月～2006年12月鹽城市第一人民醫(yī)院、鹽城市腫瘤醫(yī)院、鹽城市第三人民醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本120例。全部病例均行常規(guī)病理檢查，明確診斷與臨床分期。120例標(biāo)本中，男性84例，女性36例，男、女比例為1:0.43；年齡34～78歲，中位年齡60歲，小于60歲的有51例，大于60歲的有69例。全部病例術(shù)前均未接受過化療及放療。取10例肺癌周邊相對正常的肺組織作為對照組，所有組織均用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，作HE及免疫組化染色。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體NET-1由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室惠贈，美國舊金山基因生物公司協(xié)助合成，鼠抗人單克隆抗體EGFR、SP免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 常規(guī)脫蠟水化，組織抗原微波修復(fù)，10%山羊血清封閉。NET-1抗體的工作濃度為1:20，EGFR抗體的工作濃度為1:50，免疫組化染色SP法按說明書操作步驟進(jìn)行，DAB-H2O2顯微鏡控制下顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水中性樹膠封片。使用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 NET-1陽性染色定位于肺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，呈棕黃色顆粒，對陽性表達(dá)采用半定量積分法判斷，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度呈淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細(xì)胞百分比和染色強度兩項積分相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)[6]。EGFR的陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜上、個別位于胞核上呈棕黃色顆粒。光鏡下選擇5個表達(dá)EGFR相對較多的區(qū)域，在高倍鏡視野下每個視野分別計數(shù)200個細(xì)胞，共計1000個細(xì)胞，按陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行分級：陰性（-）為無棕黃色染色或染色陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)<10%；弱陽性（+）為陽性細(xì)胞數(shù) 10%～<25%；中等陽性（++）為陽性細(xì)胞數(shù) 25%～<50%；強陽性（+++）為陽性細(xì)胞數(shù)≥50 %。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用spss11.5英文版統(tǒng)計分析軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。率的比較采用x2檢驗和Fisher-exact檢驗，對影響生存預(yù)后的聯(lián)合效應(yīng)采用 Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，納入的變量為性別、年齡、病變部位、臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，采用Spearman等級相關(guān)分析兩指標(biāo)間的關(guān)系。P<0.05有統(tǒng)計意義，所有檢驗和 P均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 對照組與肺癌組NET-1、EGFR表達(dá)情況的比較 NET-1陽性表達(dá)于肺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或胞膜上，EGFR陽性表達(dá)于肺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或核膜上（附圖1～4）。120例肺癌中，NET-1、EGFR陽性率分別為85.00%（102/120）、69.16%（83/120）；對照組10例中陽性率分別為40.00%（4/10）、10.00%（1/10）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，肺癌組與對照組之間NET-1、EGFR的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.0842，P=0.004；χ2=14.6362，P=0.002）。見附表1。

附表1 NET-1、EGFR在肺癌組與對照組中表達(dá)的比較

2.2 肺癌組織中NET-1、EGFR的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 肺癌組織中NET-1、EGFR的表達(dá)與腫瘤的臨床分期、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），而與患者性別、年齡、病變部位無顯著相關(guān)（P>0.05）。見附表2。

2.3 肺癌組織中NET-1、EGFR表達(dá)的關(guān)系筆者配對觀察了120例肺癌組織中NET-1、EGFR表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者同時為強陽性表達(dá)者20例，同時為陰性表達(dá)者11例，兩者的表達(dá)有相關(guān)性（χ2=51.8097，P=0.000），進(jìn)一步做spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者在肺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.6107，P=0.000）。見附表3。

附表2 NET-1、EGFR的表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系

附表3 NET-1、EGFR在肺癌組織中表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

四聚體超家族（TM4SF）是一組含有4個疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，在細(xì)胞外形成兩個大小不等的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氨基端和羧基端位于胞漿內(nèi)。長度較短。這些分子之間有很多高度保守的序列，并且大多數(shù)同源性序列都位于跨膜區(qū)域[7]。從1990年發(fā)現(xiàn)至今，TM4SF的成員已發(fā)展到了25個，NET-1基因是TM4SF家族成員之一，定位于1p34.1，其mRNA全長為1297bp，編碼序列為128-853bp，有241個氨基酸的開放閱讀框[1]。陳莉等[8]通過RT-PCR技術(shù)篩檢人類48種組織與相應(yīng)腫瘤，發(fā)現(xiàn)除造血系統(tǒng)組織與相應(yīng)腫瘤、心、腦、胰不表達(dá)外，幾乎所有的人類組織及相應(yīng)腫瘤均表達(dá)NET-1基因。本研究結(jié)果顯示，NET-1基因在肺癌組織與正常肺組織中表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在臨床分期晚、分化程度低、有淋巴結(jié)組的表達(dá)水平顯著升高，提示NET-1作為一種胞質(zhì)蛋白可能可以傳導(dǎo)細(xì)胞分裂的信息和/或引起細(xì)胞異向分化或去分化，它的過度表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)，可明顯上調(diào)肺癌的惡性進(jìn)展過程。

附圖1 低分化腺癌NET-1高表達(dá)陽性定位于癌細(xì)胞質(zhì)（SP×400）

附圖2 低分化鱗癌NET-1高表達(dá)陽性定位于癌細(xì)胞質(zhì)（SP×400）

附圖3 低分化腺癌EGFR高表達(dá)陽性定位于癌細(xì)胞質(zhì)與核（SP×400）

附圖4 高分化鱗癌EGFR高表達(dá)陽性定位于癌細(xì)胞質(zhì)（SP×400）

EGFR是一個由原癌基因c-erbB-1編碼的相對分子質(zhì)量為 170000的跨膜糖蛋白，是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，廣泛分布于除成熟骨骼肌細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層和造血組織以外的所有組織細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中存在EGFR的高表達(dá)[9][10]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中EGFR蛋白的表達(dá)較正常組織明顯升高，且在低分化、高分期有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中EGFR表達(dá)顯著高于高分化、低分期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，與文獻(xiàn)報道一致。由于酪氨酸激酶是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的必要條件，因此，筆者認(rèn)為在肺癌組織中EGFR與其配體結(jié)合后使得酪氨酸激酶磷酸化而激活酪氨酸激酶，通過催化與肌醇磷脂代謝有關(guān)的酶、激酶，調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，促進(jìn)產(chǎn)生第二信使，導(dǎo)致核內(nèi)原癌基因c-myc、c-fos表達(dá)刺激肺癌細(xì)胞發(fā)生增殖，與肺癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。

盡管TM4SF蛋白的生物學(xué)功能不十分清楚，但有報道認(rèn)為TM4SF與細(xì)胞粘附分子整合素的協(xié)同作用可特異性地調(diào)控后配體整合素依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：影響粘附依賴性下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，包括細(xì)胞蛋白的酪氨酸激酶的磷酸化和絲氨酸、蘇氨酸激酶PKB/c.Akt的激活，進(jìn)而影響細(xì)胞的運動和分化。筆者對肺癌組織中NET-1與EGFR的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果提示兩者呈正相關(guān)，因此猜測在肺癌的發(fā)生、惡性進(jìn)展中，EGFR作為一種酪氨酸激酶受體在其活化途徑中有受到TM4SF蛋白影響的可能性，兩者可協(xié)同調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與增殖。本研究結(jié)果顯示NET-1和EGFR在肺癌的發(fā)生、惡性進(jìn)展中發(fā)揮了不可或缺的作用，且可能存在協(xié)同作用，因此二者聯(lián)合檢測可作為評估肺癌惡性程度指標(biāo)。