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    2010年能力驗證盲樣樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

    2011-10-16 13:28:02北京市海淀區(qū)藥品檢驗所100083楊帆
    首都食品與醫(yī)藥 2011年20期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)毒素附表試劑

    北京市海淀區(qū)藥品檢驗所(100083)楊帆

    本研究參照《中國藥典》2005年版第二部中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”試驗的基本原理和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾/確證試驗的設(shè)計[1][2],建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器 盲樣凍干粉(70-A;70-B;70-C)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品批號:150601-200862,規(guī)格:120 EU/ml,由中國藥品生物制品檢定所提供。鱟試劑批號:0904230,裝量:0.1ml/支,靈敏度:0.25EU/ml,由湛江博康海洋生物有限公司提供。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)批號:090511,裝量:2ml/支,由湛江博康海洋生物有限公司提供。ZH-Z型自動旋渦混合器,由天津市天大天發(fā)科技有限公司提供。HHSIINII型電熱恒溫水浴箱,由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠提供。

    1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值(L)的計算 樣品在實驗前需用1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶,3份樣品根據(jù)能力驗證計劃作業(yè)指導(dǎo)書設(shè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值均為“應(yīng)小于50EU/ml。

    1.3 鱟試劑靈敏度(λ)復(fù)核試驗 按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素靈敏度復(fù)核項下進(jìn)行試驗[1],結(jié)果所用鱟試劑靈敏度均在0.5~2.0λ范圍內(nèi),符合規(guī)定,可用于本試驗。

    1.4 干擾試驗 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的計算。盲樣樣品的內(nèi)毒素限度值設(shè)定L=50EU/ml,且濃度為1ml/ml,對應(yīng)于靈敏度λ=0.25 EU/ml的鱟試劑,注射用環(huán)磷腺苷內(nèi)毒素檢測最低有效稀釋倍數(shù)為MVD=c×L/λ=200。

    1.5 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗 根據(jù)干擾試驗結(jié)果,選擇200倍稀釋后的供試品液試驗。然后用λ=0.25EU/ml的鱟試劑試驗,并設(shè)供試品陽性對照(2λ)、陰性對照和陽性對照(2λ)。再取λ=0.25EU/ml的鱟試劑16支,分別用0.1 ml BET水溶解,再加入配制好的供試品稀釋液0.1ml,每種藥液平行做2管,37℃保溫,60min后觀察結(jié)果。

    2 試驗結(jié)果

    2.1 鱟試劑靈敏度(λ)復(fù)核試驗 試驗結(jié)果表明,復(fù)核靈敏度λc=λ,鱟試劑靈敏度標(biāo)示符合規(guī)定。見附表1。

    附表1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗

    2.2 干擾試驗結(jié)果 各濃度對鱟試劑均無干擾,因其理論稀釋倍數(shù)為200倍,所以確定供試品濃度0.25EU/ml為最終有效稀釋濃度。見附表2。MVD=c×L/λ=1×50/0.25=200(倍)。

    2.3 確證試驗結(jié)果 當(dāng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的Es值在0.5~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)時,而供試品的Et值在0.5~2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)時,即無干擾作用。反之,則有。供試品的濃度在0.25EU/ml時,對以上3個樣品的鱟試劑均未產(chǎn)生干擾作用。結(jié)果見附表2。

    2.4 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗 本試驗條件下,按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則進(jìn)行試驗,可以用稀釋方法排除干擾;對供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢測。

    2.5 供試品檢查

    2.5.1 溫度控制 實驗前接通恒溫儀電源,溫度調(diào)至(37+1)℃。

    2.5.2 細(xì)菌內(nèi)毒素溶液制備

    2.5.3 供試品陽性對照溶液的制備 分別取0.5ml 2倍濃度的供試品+0.5ml 4λ的內(nèi)毒素制成混合均勻的供試品陽性對照溶液,備用。

    2.5.4 鱟試劑的準(zhǔn)備 取鱟試劑16支,0.1ml/支,按標(biāo)示量加入BET用水復(fù)溶,備用。

    2.5.6 試驗加樣 結(jié)果見附表3。

    2.5.7 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果 見附表4。

    3 結(jié)論

    本研究結(jié)果表明,盲樣70-B、70-C的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于理論限值50EU/ml,70-A的細(xì)菌內(nèi)毒素含量大于理論限值50EU/ml。

    附表2 鱟試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果

    附表3 試驗加樣表(ml)

    附表4 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

    4 討論

    4.1 由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好,快速、方便,一次可檢查多批檢品,使用性強(qiáng),故用本方法來檢查細(xì)菌內(nèi)毒素含量,達(dá)到安全用藥的目的。

    4.2 本文先通過干擾試驗確定供試品的有效稀釋濃度,再由確證試驗進(jìn)一步修整,以減少干擾試驗的盲目性,避免浪費試劑,節(jié)省時間。鱟試劑要求的pH值范圍和其他因素可以通過稀釋來排除干擾[3][4]。

    4.3 假陽性或高陽性的原因:①所用試管、針頭、注射器未完全消除熱原。②溶解鱟試劑時,用力太大,產(chǎn)生較多泡沫,產(chǎn)生假陽性。③操作環(huán)境污染。④鱟試劑的靈敏度不符合規(guī)定,易呈現(xiàn)高陽性。⑤由于凝聚反應(yīng)是不可逆的,所以在恒溫反應(yīng)過程及觀察結(jié)果時,應(yīng)注意不要使試管受到振動,以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性。⑥每次稀釋倍數(shù)不得超過10倍。

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