原子熒光光譜法測(cè)定富硒螺旋藻片中不同形態(tài)、價(jià)態(tài)的硒

王 梅，張紅香，鄒志輝，楊冰儀，陳 健

(1.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺(tái) 264003)

原子熒光光譜法測(cè)定富硒螺旋藻片中不同形態(tài)、價(jià)態(tài)的硒

王 梅1，張紅香2，鄒志輝1，楊冰儀1，陳 健1

(1.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺(tái) 264003)

采用氫化物發(fā)生原子熒光法測(cè)定兩種富硒螺旋藻片中不同形態(tài)和價(jià)態(tài)的硒含量。研究?jī)x器原子化器高度、鹽酸、硼氫化鉀濃度對(duì)硒熒光信號(hào)值的影響，比較微波和濕法消化兩種消化方法，以及反復(fù)凍融和超聲波細(xì)胞粉碎法對(duì)蛋白溶出率的影響。結(jié)果顯示，兩種消化方法無顯著性差異(P=0.6900)，反復(fù)凍融法所得硒含量?jī)H為超聲波細(xì)胞粉碎法的25%～30%，超聲波細(xì)胞粉碎法優(yōu)于反復(fù)凍融法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)得兩種富硒螺旋藻片硒含量有顯著性差異(P＜0.0001)，但都存在無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)的硒，并以有機(jī)硒為主，占60%左右，且主要是以蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，無機(jī)態(tài)的四價(jià)硒和六價(jià)硒含量，樣品1有顯著性差異(P=0.0094)，但樣品2的四價(jià)硒和六價(jià)硒含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.2269)。方法的檢出限為0.64ng/g，加標(biāo)回收率為93.0%～98.8%，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，可作為不同形態(tài)和價(jià)態(tài)的硒含量的測(cè)定方法。

原子熒光；富硒螺旋藻片；硒；形態(tài)；價(jià)態(tài)

硒(selenium)是唯一受基因調(diào)控的人體必需微量元素，具有多種重要的生物學(xué)功能，硒的缺乏和過剩都將導(dǎo)致多種疾病[1-2]。我國(guó)大部分地區(qū)為缺硒、少硒地區(qū)，一般是通過食品強(qiáng)化來解決補(bǔ)硒問題。近年來許多微生物、植物甚至動(dòng)物都被作為硒的生物有機(jī)化載體進(jìn)行研究，且已開發(fā)出高附加值的富硒產(chǎn)品，富硒螺旋藻就是其中之一。

目前，國(guó)內(nèi)富硒螺旋藻中的硒形態(tài)分析主要采用熒光法[3-4]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES)[5]，但還未見應(yīng)用原子熒光光譜法研究富硒螺旋藻中硒形態(tài)、價(jià)態(tài)的報(bào)道。螺旋藻片在加工過程中因加入了其他的輔料，介質(zhì)比較復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)樣品前處理、原子化高度、載流、硼氫化鉀質(zhì)量濃度等方面進(jìn)行研究，旨在建立采用原子熒光光譜法對(duì)富硒螺旋藻片中的硒形態(tài)、價(jià)態(tài)分析的方法，以期為研究富硒螺旋藻片中硒的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒螺旋藻片2種均為市售品牌，標(biāo)記為樣品1和樣品2。樣品經(jīng)55～60℃干燥24h，研磨后使用。

1mg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；40μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)使用液，臨用前逐級(jí)稀釋；實(shí)驗(yàn)用試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純；實(shí)驗(yàn)用水為3次石英亞沸蒸餾水；實(shí)驗(yàn)用玻璃儀器均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸浸泡24h，再用1次水及3次蒸餾水洗凈。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-920雙道原子熒光光譜儀 北京吉天儀器有限公司；22R型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；MDS-2003型微波消解儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；EH35A型電熱板 北京萊伯泰科公司；CU-420型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；BT224S萬分之一天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 儀器工作條件

燈電流30mA，光電倍增管負(fù)高壓260V，原子化器高度9mm，載氣流量400mL/min，屏蔽氣流量800mL/min，測(cè)定方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，讀數(shù)方式為峰面積，進(jìn)樣體積1.0mL。

1.4 樣品處理

1.4.1 總硒

準(zhǔn)確稱取樣品0.1～2.0g，于50mL錐形瓶中，加入15mL HNO3-HClO4(4:1，V/V)的混合酸冷消化過夜，次日于電熱板上加熱，及時(shí)補(bǔ)加酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時(shí)，再繼續(xù)加熱至剩余體積2mL左右。冷卻，再加5mL 6mol/LHCl溶液，于電熱板上加熱趕酸至約2mL，消化液轉(zhuǎn)移到10mL比色管中，加純水定容至10mL，加入1mL 100g/L鐵氰化鉀，2mL濃鹽酸搖勻，備測(cè)[6]。每種樣品平行測(cè)定6份，同時(shí)做試劑空白。

1.4.2 無機(jī)硒與有機(jī)硒

準(zhǔn)確稱取樣品0.1～2.0g，加入10mL的3次蒸餾水，沸水浴30min，然后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎細(xì)胞壁(功率550W，超聲時(shí)間4s，間隔時(shí)間4s，超聲60次)，20℃條件5000r/min離心10min。殘?jiān)喜襟E再提取，合并上清液，濃縮至5mL左右，按1.4.1節(jié)步驟消解，所得消解液用于測(cè)定的硒即為無機(jī)硒含量。

將總硒減去無機(jī)硒作為有機(jī)硒的含量。

1.4.3 Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)

將無機(jī)硒提取液濃縮消化后，不加入6mol/L HCl溶液還原，只加入100g/L鐵氰化鉀溶液抗干擾劑所測(cè)出的為四價(jià)硒，六價(jià)硒的含量為無機(jī)硒的含量減去四價(jià)硒的含量。

1.4.4 蛋白質(zhì)中的硒

準(zhǔn)確稱取樣品0.1～2.0g，加pH8.6 Tris-HCl緩沖液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甘油、20.0mmol/L MgCl2·6H2O)10.0mL混合，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，使細(xì)胞全部破碎。攪拌提取2次，以4℃條件下11000r/min離心10min，上清液合并；加入固體硫酸銨至飽和，靜置2h，以15000r/min離心10min，收集沉淀；用5mL的緩沖液溶解沉淀，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為7000的透析袋在蒸餾水中透析去除硫酸銨，收集蛋白質(zhì)溶液[4]，再按1.4.1節(jié)步驟消解。

1.4.5 多糖中的硒

準(zhǔn)確稱取樣品0.1～2.0g，先用95%乙醇溶液脫脂，再加10mL三次蒸餾水，80℃恒溫加熱4h，離心(3000r/min，20min收集上清液，沉淀再加水10mL， 80℃恒溫加熱4h，抽提2次，合并上清液。上清液濃縮至5mL左右，用80%丙酮溶液脫色，再用95%乙醇溶液沉淀，離心，合并兩次所得沉淀[7-8]，再按照1.4.1節(jié)方法消化。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)分析主要利用SAS 9.1，統(tǒng)計(jì)分析方法主要有t檢驗(yàn)、t′檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定條件的選擇

以10μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，考察鹽酸載流濃度、硼氫化鉀質(zhì)量濃度、原子化器高度3個(gè)因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸，10g/L硼氫化鉀，原子化高度9mm為最佳測(cè)定條件。

2.2 微波消化與濕消化法的比較

分別采用微波和濕法消化對(duì)兩種樣品進(jìn)行前處理，測(cè)定結(jié)果表明兩種消化方法無顯著性差異(P=0.6900)。微波消化可以避免揮發(fā)性元素的損失，且較少有污染發(fā)生，但每次處理樣品量較少，通常為0.1～0.5g，對(duì)含量較低的元素測(cè)定不適用。濕法消化是應(yīng)用普遍的方法，其特點(diǎn)是單次處理樣品數(shù)量較大，可達(dá)到10g以上，基本能滿足植物樣品中微量元素測(cè)定的要求?？紤]到樣品2含硒量比較低，稱樣量達(dá)到2.0g左右，且因富硒螺旋藻片在加工過程中加入了其他的輔料，介質(zhì)比較復(fù)雜，消化時(shí)有較多氣泡產(chǎn)生，微波消化預(yù)處理時(shí)間較長(zhǎng)，故選用濕消化法。

2.3 關(guān)于藻體蛋白提取的方法比較

參考劉力闖[9]、鄭江[10]、黃峙[4]等對(duì)于螺旋藻中蛋白的提取，采用反復(fù)冷凍鹽析法和超聲波細(xì)胞粉碎法提取藻體蛋白，利用所測(cè)得硒含量來對(duì)比兩種方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明冷凍鹽析法所得硒含量?jī)H為超聲波細(xì)胞粉碎法的25%～30%，可見冷凍法的蛋白溶出率比超聲波細(xì)胞粉碎法的蛋白溶出率低得多，故選用超聲波細(xì)胞粉碎法提取富硒螺旋藻中蛋白。

2.4 富硒螺旋藻片中硒形態(tài)、價(jià)態(tài)及含量

螺旋藻是硒生物有機(jī)化的理想載體[3,11-12]。硒的生物效應(yīng)與其化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)。硒在生物體內(nèi)的存在形態(tài)可分為有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)，無機(jī)硒毒性大，而有機(jī)硒毒性小、生物利用率高。有機(jī)硒主要存在蛋白、多糖和脂質(zhì)中。無機(jī)硒有單質(zhì)硒(Se 0)、4價(jià)硒(Se Ⅳ)及6價(jià)硒(Se Ⅵ)之分[3]。因此不同形態(tài)、價(jià)態(tài)的硒含量是評(píng)價(jià)某一富硒產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。

氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)硒具有靈敏度高、干擾小、線性范圍寬、所用試劑毒性小等優(yōu)點(diǎn)，特別在硒價(jià)態(tài)分析方面具有方便快捷的優(yōu)勢(shì)[13-15]。

硒形態(tài)、價(jià)態(tài)分析結(jié)果表明(表1)，兩種富硒螺旋藻片硒含量有顯著性差異(P＜0.0001)，樣品1總硒含量是樣品2的2000多倍，但都存在無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)的硒，且以有機(jī)硒為主，占60%左右，樣品1中無機(jī)態(tài)的四價(jià)硒和六價(jià)硒含量有顯著性差異(P=0.0094)，但樣品2的四價(jià)硒和六價(jià)硒含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.2269)。由此看出，富硒螺旋藻片中硒的有機(jī)化程度較高，可較好地被生物所吸收利用。

表1 富硒螺旋藻片中硒形態(tài)、價(jià)態(tài)及含量(n=6)Table 1 Chemical states, valences and contents of Se in Se-enrichedS.pirulinatablets (n=6)

2.5 有機(jī)硒在螺旋藻片中的分布

有機(jī)硒主要指以負(fù)2價(jià)態(tài)結(jié)合在蛋白質(zhì)、脂、多糖、核酸、氨基酸、多酚、甾類化合物等有機(jī)分子特別是生物分子中的硒。由表2可知，兩種樣品中蛋白質(zhì)和多糖含硒量均有顯著性差異(P＜0.0001)，有機(jī)硒在螺旋藻中的分布從大到小為蛋白質(zhì)、多糖，且蛋白質(zhì)結(jié)合的硒占有機(jī)硒的比例超過50%，遠(yuǎn)高于多糖，說明有機(jī)硒主要是以蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在。

表2 蛋白質(zhì)、多糖中的含硒量(n=6)Table 2 Protein-bound selenium and polysaccharide-bound selenium contents in Se-enrichedS.pirulinatablets (n=6)

2.6 檢測(cè)限和加標(biāo)回收率

按照硒總量的測(cè)定方法，以3次蒸餾水代替樣品進(jìn)行6份空白實(shí)驗(yàn)，根據(jù)空白值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)，按3σ計(jì)算出方法檢出限為0.64ng/g，測(cè)量10次樣品得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.7%。實(shí)驗(yàn)采用加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)考察測(cè)量方法的準(zhǔn)確性(表3)，其中樣品1的加標(biāo)回收率為95.6%～98.8%，樣品2的加標(biāo)回收率為93.0%～96.2%，說明方法準(zhǔn)確度較高。

表3 總硒加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 3 Recovery rates for Se in Se-enrichedS.pirulinatablets

3 結(jié) 論

采用原子熒光光譜法分析了富硒螺旋藻片中的硒形態(tài)和價(jià)態(tài)，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬，為研究富硒螺旋藻片中硒的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)提供基礎(chǔ)。結(jié)果表明，不同品牌的富硒螺旋藻片硒含量有顯著性差異(P＜0.0001)，但不同形態(tài)、價(jià)態(tài)的硒在螺旋藻片中分布基本一致，并以有機(jī)硒為主，且主要是以蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，硒的有機(jī)化程度較高。富硒螺旋藻片作為一種硒營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食物，不同品牌硒含量有較大差別，高達(dá)2000多倍，這樣人們就很難控制硒攝入量，國(guó)家法規(guī)政策若能有針對(duì)性的控制硒含量在一定的范圍內(nèi)，可以使富硒螺旋藻片品質(zhì)得到優(yōu)化，從而提高此類產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)性和安全性。

[1] 徐輝碧. 硒的化學(xué)、生物化學(xué)及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[M]. 武漢:華中理工大學(xué)出版社, 1994: 104-194.

[2] 徐芳, 邱德仁, 楊芃原, 等. 硒的化學(xué)與生物形態(tài)分析綜述[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2002, (2): 331-340.

[3] 黃峙, 鄭文杰, 向軍儉, 等. 硒硫比值對(duì)鈍頂螺旋藻有機(jī)化硒的影響及藻體中硒的形態(tài)、價(jià)態(tài)構(gòu)成[J]. 海洋科學(xué), 2002, 26(5): 60-62.

[4] 黃峙, 向軍儉, 鄭文杰, 等. 鈍頂螺旋藻富集轉(zhuǎn)化硒及硒在藻體中的分布[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2001, 37(1): 12-14.

[5] 陳填烽, 崔小峰, 楊芳, 等. 分次加硒法培養(yǎng)高富硒量螺旋藻及其對(duì)藻體光合色素和蛋白質(zhì)含量影響的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005,31(8): 48-51.

[6] 北京市衛(wèi)生防疫站、衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督所和中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所. GB/T 5009.93—2003食品中硒的測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[7] 胡群寶, 郭寶江. 螺旋藻多糖和糖蛋白的提純及其理化特性研究[J].海洋科學(xué), 2001, 25(7): 41-44.

[8] 周志剛, 李富朋, 劉志禮, 等. 三種螺旋藻及其蛋白質(zhì)、多糖和脂類結(jié)合硒的研究[J]. 海洋與湖沼, 1997, 28(4): 363-370.

[9] 劉立闖, 胡志和, 劉彤, 等. 螺旋藻蛋白提取方法比較研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(11): 228-233.

[10] 鄭江. 藻膽蛋白的提取純化研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(11):159-161.

[11] LI Zhiyong, GUO Siyuan, LI Lin. Bioeffects of selenite on the growth ofSpirulinaplatensis and its biotransformation[J]. Bioresource Technology,2003, 89(2): 171-176.

[12] CASES J, WYSOCKA I A, CAPORICCIO B, et al. Assessment of selenium bioavailability from high-seleniumSpirulinasubfractions in selenium-deficient rats[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(13): 3867-3873.

[13] 李連平, 范威, 黃志勇, 等. 蔬菜中硒總量及形態(tài)的氫化物發(fā)生-原子熒光光譜測(cè)定方法[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2008, 28(12): 2975-2978.

[14] 刁娟娟, 李莉, 陽(yáng)勝, 等. 氫化物原子熒光法測(cè)定大蒜及其制品中的硒[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(4): 166-168.

[15] 陳新, 柳閩生, 鮮華. 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測(cè)定紫甘薯中的有機(jī)硒和無機(jī)硒[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(7): 163-165.

Determination of Chemical State and Valence for Selenium in Se-enrichedS.pirulinaTablets by Atomic Fluorescence Spectrometry

WANG Mei1，ZHANG Hong-xiang2，ZOU Zhi-hui1，YANG Bing-yi1，CHEN Jian1
(1. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, China；2. Shandong Luye Pharma Group Co. Ltd., Yantai 264003, China)

Selenium contents with different chemical states and valences in two kinds of Se-enrichedS.pirulinatablets were determined by atomic fluorescence spectrometry generated from hydride. The effects of atomizer height, HCl concentration and KBH4 concentration on Se fluorescence signal were investigated. The microwave digestion and wet digestion were also compared.In addition, the effects of ultrasonic cell-break method and repeated freezing-thaw method on the extraction rate of protein were explored. Results indicated that two digestion methods had no significant difference (P= 0.6900), and selenium content in samples treated by repeated freezing-thaw method was only 25%－30% of that treated by ultrasonic cell-break method, which suggested that ultrasonic cell-break method was better than repeated freezing-thaw method. Under the optimal conditions,selenium contents in Se-enrichedS.pirulinatablets were significant difference (P< 0.0001). Although both inorganic Se and organic Se co-existed, the organic Se in the states of Se (IV) and Se (VI) was still prominent, which was up to 60%. The contents of Se in both states in sample 1 revealed a significant difference (P= 0.0094), but the contents of Se in both states in sample 2 had no significant difference(P= 0.2269). The detection limit of this method was 0.64 ng/g, and the recovery rate of spiked samples was in the range of 93.0%－98.8%. Therefore, this method is characteristics of simple operation, high sensitivity and low detection limit, and provides a theoretical reference for determining the content of Se in different states and valences from Se-enrichedS.pirulinatablets.

atomic fluorescence spectrometry；Se-enrichedS.pirulinatablets；Se；chemical state；valence

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0179-04

2010-04-15

王梅(1978—)，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事衛(wèi)生檢驗(yàn)與食品分析研究。E-mail：wmei02@163.com