斯氏并殖吸蟲感染犬肝、肺組織中JAK-STAT和 NF-Κ β 的表達(dá)*

李珍煉，黃玉清，張錫林，陳文碧，王光西

并殖吸蟲?。╬aragonimiasis，又稱肺吸蟲?。┦且活愔匾氖吃葱匀双F共患寄生蟲病，廣泛分布于亞洲、非洲與拉丁美洲許多國家[1]。肺吸蟲的種類較多，我國以衛(wèi)氏并殖吸蟲和斯氏并殖吸蟲居多，由于并殖吸蟲成蟲與童蟲均具有游走性，在人體除引起肺部病變外，還可移行至肝臟、心包、睪丸、皮下組織，特別是幼蟲可經(jīng)縱隔、頸部移行至顱內(nèi)，侵犯腦組織，可表現(xiàn)為癲癇、腦炎、偏癱，危害嚴(yán)重。蟲體在組織器官內(nèi)移行、寄居的機械破壞作用，蟲體代謝產(chǎn)物引起的免疫病理反應(yīng)，可導(dǎo)致肝、肺、腦出現(xiàn)炎癥、出血、膿腫、囊腫、纖維化等病理改變[2]。臨床表現(xiàn)極其復(fù)雜。近年來研究顯示眾多信號通路參與了全身性炎癥反應(yīng)和組織損害的病理過程。細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的 JAK-STAT[3]（janus kinase/signal transducerand activator of transcription，JAKSTAT）通路廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥、腫瘤的發(fā)生等病理生理過程，對機體產(chǎn)生重要影響；核轉(zhuǎn)錄因子-Κ β（nuclear factor-kappaB ，NFΚ β）是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子[4]，廣泛存在于真核生物中。體內(nèi)外的多種刺激，如缺氧、缺血、氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)等均可激活 NF-Κ β；然而關(guān)于其在肺吸蟲病損傷的肝、肺組織中的表達(dá)變化和意義少有報道。本實驗以腹腔注射囊蚴感染法建立肺吸蟲病動物模型，旨在觀察JAK-STAT和 NF-Κ β通路在斯氏并殖吸蟲所致肝、肺組織損傷中的表達(dá)及其作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗動物 溪蟹采自四川省興文縣先鋒鎮(zhèn)肺吸蟲病流行區(qū)；健康清潔級家犬，共10只，由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要實驗試劑 兔抗人STAT多克隆抗體、兔抗人NF-kB（P65）多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）購于Sigma公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB），多聚甲醛，戊巴比妥鈉，10%福爾馬林。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立肺吸蟲病感染動物模型 將采自肺吸蟲病流行區(qū)的溪蟹洗凈、研碎、過濾、沉淀，在解剖顯微鏡下分離囊蚴，采用腹腔注射囊蚴法感染家犬，感染組8只，每只犬注射200個囊蚴，不感染的犬2只，為正常對照組，飼養(yǎng)觀察三個月。

1.2.2 動物解剖和取材 感染三月后解剖犬，自肺蟲囊取出蟲體，經(jīng)鑒定為斯氏并殖吸蟲成蟲。取肺、肝組織；用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化；以免疫組化染色法檢測肺和肝組織STAT和NFΚ β的表達(dá) 。

1.2.3 免疫組化法檢測 STAT和NF-Κ β的表達(dá)測定步驟：組織切片，常規(guī)脫蠟水化后，蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡，高溫抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并用正常山羊血清封閉交叉反應(yīng)。滴加一抗即兔抗人STAT多克隆抗體（1∶200）、兔抗人NF-kB（P65）多克隆抗體（1∶200）孵育，PBS 沖洗后滴加生物素標(biāo)記二抗即羊抗兔IgG室溫孵育20min，PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/H RP）孵育 ，PBS沖洗 ，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片觀察。免疫組化同時加作陰性對照片（PBS代替一抗）。

STAT和NF-Κ β結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞為細(xì)胞染成棕黃色或有棕黃色顆粒沉積，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。由二位病理醫(yī)生按雙盲法對免疫組化結(jié)果進行評估，即在高倍鏡下（×200）隨機觀察10個視野，計數(shù)1 000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計算出陽性細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，進行多因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 H E染色光鏡觀察結(jié)果 觀察到感染犬肺和肝切片斯氏并殖吸蟲蟲卵周圍有大量的炎癥細(xì)胞浸潤。感染犬肺可見蟲體隧道，肺泡上皮壞死，炎癥細(xì)胞浸潤；肝組織可見蟲體隧道，肝細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，見大片壞死并有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及嗜酸性膿腫形成，壞死周圍肉芽腫及纖維組織包裹，見夏科-雷登氏結(jié)晶；肝細(xì)胞氣球樣變，萎縮、變性、壞死，肝細(xì)胞核濃縮，界限不清；匯管區(qū)水腫，伴炎性細(xì)胞浸潤，肝竇擴張、瘀血；小膽管及結(jié)締組織增生，有蟲卵沉積壞死灶。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 犬肺組織中 JAK-STAT和NF-Κ β 免疫組化染色顯示正常對照組犬肺組織中JAK-STAT和NF-Κ β不表達(dá)或弱陽性表達(dá)（見圖1A和圖1C）；感染組犬肺組織可見JAK-STAT和NF-Κ β陽性細(xì)胞，免疫陽性物質(zhì)呈棕褐色，NF-Κ β在肺氣道處表達(dá)多，STAT在肺實質(zhì)處表達(dá)多 （見圖1B和圖1D），感染組和正常組之間存在顯著性差異（χ2=476，χ2=521，P ＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義（表 1）。

2.2.2 犬肝組織中 JAK-STAT和NF-Κ β 免疫組化染色顯示正常對照組犬肝組織中JAK-STAT和NF-Κ β不表達(dá)或弱陽性表達(dá)（圖 2A 和圖 2C）；感染組犬肝組織可見JAK-STAT和NF-Κ β陽性細(xì)胞，免疫陽性物質(zhì)呈棕褐色，以肝細(xì)胞壞死區(qū)最為明顯，胞質(zhì)和胞核中均可見陽性表達(dá)（圖2B和圖2D）。感染組和正常組之間存在顯著性差異（χ2=405，χ2=434，P ＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

3 討 論

斯氏并殖吸蟲病是肺吸蟲的童蟲在人體內(nèi)移行或寄居所引起的疾病。成蟲寄生于犬、貓、果子貍等終宿主肺部，產(chǎn)出的蟲卵隨痰吞咽后隨糞便排出，在水中發(fā)育孵出毛蚴，侵入擬釘螺發(fā)育，形成許多尾蚴逸出螺體，再侵入淡水蟹體內(nèi)發(fā)育成囊蚴。當(dāng)人生食或半生食含囊蚴的淡水蟹后，在小腸內(nèi)受到消化液作用，幼蟲脫囊而出，幼蟲鉆過腸壁，侵入腹腔竄擾，較少發(fā)育成蟲，而是以幼蟲狀態(tài)移行至肝、胸腔、心包、睪丸、皮下組織，或經(jīng)縱隔，進入顱內(nèi)形成腦型肺吸蟲病。斯氏并殖吸蟲病的致病作用主要由童蟲移行的機械性損傷、蟲體代謝產(chǎn)物等抗原物質(zhì)導(dǎo)致的免疫病理反應(yīng)引起，出現(xiàn)皮膚型、內(nèi)臟型肺吸蟲病[5]。

圖1 犬肺組織 NF-Κ β和JAK-STAT免疫組化染色表現(xiàn)圖1A.正常對照組犬肺NF-Κ β在肺實質(zhì)處低陽性表達(dá)圖1B.斯氏并殖吸蟲感染犬肺組織，NF-Κ β在肺氣道處陽性表達(dá)圖1C.正常對照組犬肺JAK-STAT在氣道處低陽性表達(dá)圖1D.斯氏并殖吸蟲感染犬肺組織，JAK-STAT在肺實質(zhì)處陽性表達(dá)Fig.1 Expression of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the lung tissueFig.1A NF-Κ β low expression in the lung of the normal control dogFig.1B NF-Κ β positive expression in the lung of the dog infected with Pagumogonimus skrjabiniFig.1C JAK-STAT low expression in the lung of the normal control dogFig.1D JAK-STAT positive expression in the lung of the dog infected with Pagumogonimus skrjabini

圖2 犬肝組織NF-Κ β和JAK-STAT免疫組化染色表現(xiàn)圖2A.正常對照組犬肝組織NF-Κ β低陽性表達(dá)圖2B.斯氏并殖吸蟲感染犬肝組織NF-Κ β陽性表達(dá)圖2C.正常對照組犬肝組織JAK-STAT低陽性表達(dá)圖2D.斯氏并殖吸蟲感染犬肝組織JAK-STAT陽性表達(dá)Fig.2 Expression of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the liver tissueFig.2A NF-Κ β low expression in the liver of the normal control dogFig.2B NF-Κ β positive expression in the liver of the dog infected with PagumogonimusskrjabiniFig.2C JAK-STAT low expression in the liver of the normal control dogFig.2D JAK-ST AT positive expression in the liver of the dog infected with Pagumogonimusskrjabini

JAK-STAT信號通路是一條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可將細(xì)胞膜感受到的信號直接傳遞至核內(nèi)，啟動基因轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞外可溶性信號分子（細(xì)胞因子、生長因子等）識別并與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合后誘導(dǎo)受體聚化形成二聚體或三聚體。在胞質(zhì)內(nèi)形成高親和力的JAKs結(jié)合位點，JAKs與該結(jié)合位點結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化或與受體交叉酪氨酸磷酸化而活化?；罨腏AKs進一步募集胞質(zhì)內(nèi)相應(yīng)信號傳遞給 STAT s，使 STATs二聚化、活化、發(fā)生核易位，結(jié)合至相應(yīng)基因啟動子區(qū)，啟動基因表達(dá)，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。目前已知有多種細(xì)胞因子，如 TNF-a、IL-6、IL-1B、干擾素（IFN）等和生長因子是通過活化 JAK-STAT通路進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的[6]。肺吸蟲病時肺、肝是炎癥反應(yīng)最為活躍器官，是炎癥和免疫細(xì)胞聚集的重要部位。肝臟是機體合成免疫效應(yīng)分子的主要部位之一，合成過程與JAK-STAT信號通路密切相關(guān)。本實驗通過建立肺吸蟲病模型，以免疫組化染色檢測JAK-STAT在肝組織中的定位和表達(dá)。觀察到正常對照組犬肝組織中JAK-STAT低陽性表達(dá)；肺吸蟲感染組，JAK-STAT信號通路被激活，活化的STAT發(fā)生核易位，直接激活目的基因表達(dá)，此時肺、肝功能和大體、組織學(xué)表現(xiàn)均出現(xiàn)異常，與JAK-STAT表達(dá)和分布的動態(tài)變化相一致，提示肺吸蟲病時JAK-STAT的表達(dá)和活化在肺、肝損傷過程中可能發(fā)揮重要作用，JAKSTAT通路參與了肺吸蟲病肺、肝損傷的病理過程。

表1 斯氏并殖吸蟲感染犬肺、肝 NF-Κ β和JAK-STAT免疫組化檢測結(jié)果Table 1 Results of detection of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the lung，liver of the dogs with paragonimiasis skrjabini

存在于真核生物中的核轉(zhuǎn)錄因子-Κ β，靜息時與其抑制蛋白IΚ β結(jié)合，以失活狀態(tài)存在細(xì)胞質(zhì)中，體內(nèi)外的多種刺激，如缺氧、缺血、氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)等均可激活NF-Κ β，當(dāng)受到激活蛋白激酶刺激時，IΚ β 磷酸化 ，泛 素化 ，降解 ，使 NF-Κ β游離 于胞 漿中，迅速發(fā)生核移位，通過它的核定位信號與DNA上相應(yīng)的Κ β位點特異結(jié)合，促進相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[4]。肺吸蟲感染，NF-Κ β 在損傷的肺 、肝中持續(xù)活化，通過許多潛在途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；而且NF-Κ β可誘導(dǎo)IL-1、ICAM-l、iN0S 、TNF-a 表達(dá)和鈣超載 、氧自由基的形成，加重肺、肝組織損害。

本實驗通過腹腔注射斯氏并殖肺吸蟲囊蚴感染犬，建立肺吸蟲病模型，取犬肺、肝組織標(biāo)本；通過HE染色、光鏡觀察到肺吸蟲感染犬的肺、肝組織細(xì)胞病理改變以及炎癥細(xì)胞反應(yīng)狀況；通過免疫化學(xué)染色方法檢測JAK-STAT和NF-Κ β炎癥信號通路表達(dá)，肺吸蟲感染犬肺、肝組織的實質(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞呈現(xiàn)陽性表達(dá)，正常對照犬陽性表達(dá)較低，二者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義；肺吸蟲病的機械破壞和炎癥病理反應(yīng)多種刺激，造成組織缺氧、缺血、氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)等均可激活JAK-STAT和 NFΚ β表達(dá) ，說明 JAK-STAT 和 NF-Κ β炎癥信號通路可能參與了肺吸蟲病肺、肝組織的病理過程，為以后我們深入肺吸蟲病的防治和基礎(chǔ)實驗研究奠定基礎(chǔ)。

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