獼猴肝臟實驗感染豬囊尾蚴的觀察*

陳崢宏,劉 峰,包懷恩,吳曉娟,楊婷秀

2.貴州省人民醫(yī)院,貴陽 550004

豬囊蟲病是由于家豬食入鏈狀帶絳蟲的蟲卵,蟲卵中幼蟲在消化液作用下逸出,移行并在皮下、肌肉和腦組織等組織器官內(nèi)發(fā)育為囊尾蚴而引起,人也可因食入蟲卵而發(fā)生囊蟲病。囊蟲病呈世界性分布,我國的流行和分布也相當廣泛,遍及全國。雖然豬囊尾蚴可寄生在中間宿主的肌肉、皮下、腦、眼等組織和器官,也包括肝臟[1-2],但往往只有臨床表現(xiàn)明顯的腦型、眼型和嚴重的皮肌型囊尾蚴病由于癲癇發(fā)作、視力障礙或皮下可見明顯結(jié)節(jié)或包塊才會引起人們的重視,肝囊蟲病由于缺乏特異的臨床表現(xiàn)使豬囊尾蚴在人肝臟的寄生和對健康的危害尚未引起人們的關(guān)注。本文以鏈狀帶絳蟲蟲卵感染獼猴,觀察獼猴肝功能、肝臟聲像圖特征及病理變化特征,并對獼猴進行血清豬囊尾蚴抗體檢查,為人肝囊尾蚴病的危害評估和臨床診斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 鏈狀帶絳蟲采自云南省大理白族自治州鳳儀鎮(zhèn)的近期有排絳蟲節(jié)片史病人,以檳榔-南瓜子法驅(qū)蟲,蟲體用自來水、0.85%生理鹽水漂洗后保存于滅菌的25%甘油水溶液運送至實驗室,經(jīng)形態(tài)學觀察和分子鑒別鑒定為鏈狀帶絳蟲。

1.2 實驗動物 普通級醫(yī)學實驗用獼猴,雌性,體重為5.9 kg,重慶碩斯靈長類動物研究有限公司提供,合格證號：SCXR(渝)2008-0001。

1.3 主要試劑 肝功能檢測試劑均為澳斯邦原裝試劑;透明質(zhì)酸放射免疫分析藥盒,購自北京北方生物技術(shù)研究所;考馬斯亮藍蛋白質(zhì)定量試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;辣根過氧化物酶標記兔抗猴IgG,TMB顯色試劑盒,購自北京博奧森生物科技公司;安定,貴州光定制藥,批號 090817;氯胺酮,江蘇恒瑞制藥,批號071005。

1.4 獼猴的感染和B超檢查 獼猴感染前抽取早晨空腹靜脈血分離血清凍存于-20℃?zhèn)溆?經(jīng)肌肉注射安定(0.2～0.3mg/kg)鎮(zhèn)靜和鹽酸氯胺酮麻醉后(5mg/kg)以PHILIPS IU22型彩色超聲儀,探頭頻率2.5～10.0 MHz,進行肝臟彩超檢查。分別將5×105個鏈狀帶絳蟲的蟲卵加入飼料內(nèi)喂食獼猴,專用飼料飼養(yǎng),并每日喂食適量新鮮水果。感染第84 d,抽取空腹靜脈血分離血清備用,麻醉后以同一臺超聲儀和同樣的探頭頻率進行肝臟B超檢查,記錄病灶數(shù)目、大小、形態(tài)、內(nèi)部及后方回聲特征,將病變區(qū)圖像局部放大,彩色多普勒血流速度量程調(diào)至低速血流狀態(tài)(3～6cm/s),觀察局部血流,并根據(jù)聲像圖特征提示超聲診斷。

1.5 獼猴感染前后部分肝功能指標的檢查 將感染前后的獼猴血清以拜耳1650全自動生化分析儀采用澳斯邦原裝試劑進行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽堿酯酶(CHE)和總膽汁酸鹽(TBA)的檢測;透明質(zhì)酸(HA)檢測采用固相放射免疫法按藥盒操作說明進行。

1.6 獼猴的剖檢、囊尾蚴的分布及肝病變組織的病原核酸檢測和病理學檢查 于感染第90d以肌肉注射安定(1 mg/kg)和氯胺酮(20mg/kg)麻醉獼猴致死,測量體重,剖檢全身各組織器官,采集囊尾蚴,并立即置于0.5%(mL/mL)膽汁鹽水中,于室溫下孵育至頭節(jié)翻出,將翻出頭節(jié)的囊尾蚴放置于一滴生理鹽水中,于載玻片上直接用光學顯微鏡觀察后加覆蓋玻片制片鏡檢。仔細檢查獼猴肝組織,取病變組織經(jīng)10%甲醛固定后進行常規(guī)石蠟切片、HE染色鏡檢。

1.7 獼猴血清中豬囊尾蚴抗體的檢查

1.7.1 豬囊尾蚴抗原的制備 將豬帶絳蟲蟲卵實驗感染的家豬肌肉內(nèi)檢獲的囊尾蚴經(jīng)PBS洗滌后用玻璃勻漿器勻漿,并用超聲波粉碎儀破碎,經(jīng)臺式離心機12 000r/min離心15min,取上清濾過除菌后以考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒定量,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 血清中豬囊尾蚴抗體的ELISA法檢測 以4.9μ g/mL的豬囊尾蚴抗原包被酶標板孔,每孔100μ L,置4℃包被過夜,洗滌液洗滌各孔,加1/10、1/100、1/200、1/400 的感染前、后獼猴血清各100μ l,每份稀釋血清重復(fù)3孔,同時設(shè)置 3孔 PBS對照。經(jīng)37℃孵育1h,洗滌后加1/1 000的辣根過氧化物酶標記兔抗猴IgG各100μ L,37℃孵育1h,以TMB顯色試劑盒按說明書操作顯色和終止后于450nm測量各孔吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 獼猴肝臟B超檢查 感染前獼猴肝臟B超檢查未見異常,感染后獼猴肝臟見11個大小較為均一的結(jié)節(jié),形態(tài)多為類圓形、橢圓形或梭形,邊界一般較清楚,均未見包膜,內(nèi)部呈不均勻的低回聲或混合性回聲,多數(shù)結(jié)節(jié)壁上有強回聲光斑且后方伴聲影(圖1)。CDFI顯示病灶內(nèi)均無血流信號,周圍可見正常的動脈、肝靜脈及門靜脈樣血流信號走行。超聲診斷提示：肝臟多發(fā)實性結(jié)節(jié)伴鈣化斑。

圖1 感染鏈狀帶絳蟲囊尾蚴84 d的獼猴肝臟超聲圖Fig.1 Liver ultrasonography of the macaque infected by T.solium larva(arrows showing nodules)

2.2 部分肝功能指標檢測 感染前和感染第84d的獼猴空腹靜脈血中部分酶及透明質(zhì)酸的檢查結(jié)果見表1。

表1 感染前后獼猴的部分肝功能指標Table 1 Indicators of liver function of the monkey before and after infection

2.3 囊尾蚴的分布及肝組織病變的病原檢查和病理學檢查 感染鏈狀帶絳蟲囊尾蚴90天的獼猴體重為3.5kg,在獼猴肌肉內(nèi)檢獲11個囊尾蚴(圖2),心包膜下檢獲2個囊尾蚴,肝實質(zhì)內(nèi)見11個結(jié)節(jié),大小為(1.0×1.5)～(1.5×3)mm,其余組織器官未見囊尾蚴和病變。病變組織的石蠟切片HE染色鏡檢顯示,病灶內(nèi)可見壞死的蟲體,周圍有纖維結(jié)締組織包裹伴炎癥細胞浸潤,以嗜酸性粒細胞為主,部分可見淋巴細胞浸潤及肉芽腫,肉芽腫周圍纖維結(jié)締組織增生(圖3),可見肝細胞脂肪變性(圖4)和壞死。

圖2 獼猴肌肉內(nèi)的囊尾蚴Fig.2 Cysticerci from the monkey's muscle

2.4 血清囊尾蚴抗體的ELISA檢測 感染前、后各稀釋血清ELISA檢測的OD450見表2。與PBS對照相比,以大于PBS對照孔OD值2.1倍,即大于0.202為顯色陽性,則感染后血清經(jīng)400倍稀釋,囊尾蚴抗體仍為陽性,而感染前各稀釋血清囊尾蚴抗體均為陰性。

3 討 論

表2 獼猴感染前、后血清抗體ELISA檢測的OD450(3次實驗結(jié)果均值)Table 2 OD450of the ELISAtest on the serum antibody of the monkey before and after infection(mean value of three tests)

肝寄生蟲病在我國許多地區(qū)均有流行,多為血吸蟲、肺吸蟲、包蟲及蛔蟲引起肝臟占位性病變的報道。雖然已有研究表明,除了皮膚、肌肉、眼和腦組織,家豬肝臟也是豬帶絳蟲囊尾蚴的重要寄生部位[1-2],但肝囊蟲病對人的危害尚未引起關(guān)注。本文以豬帶絳蟲蟲卵感染獼猴的實驗結(jié)果表明,豬囊尾蚴也可寄生于獼猴的肝臟。部分肝功能相關(guān)血清酶的檢測表明,感染前后獼猴血清ALT、AST數(shù)值有所差異,但均在獼猴血清ALT、AST正常值范圍之內(nèi)[3]。人的肝血清酶學指標中,ALT、AST等僅在急性或重型肝炎患者與健康正常人群表現(xiàn)出顯著的差異性,在慢性肝炎和酒精性肝炎則缺乏診斷價值[4]。TBA則是肝損傷的敏感指標[5-6],它是膽固醇在肝臟中分解的代謝產(chǎn)物,其生成和代謝與肝臟密切相關(guān)。在各種肝臟疾病時,肝臟對膽汁酸的重吸收減少,從而導(dǎo)致血清中 TBA的含量增加。因此測定血清中TBA可以直接反映肝臟的攝取、合成及排泄功能。在肝細胞有較輕微損傷時,TBA的升高比其它常規(guī)肝功能指標更敏感[5-6]。膽堿酯酶是肝細胞合成的水解酶,隨著肝臟纖維化程度的加重,CHE合成逐漸減少[6]。透明質(zhì)酸是一種廣泛存在于細胞外基質(zhì)中的高分子多糖,主要由肝內(nèi)皮細胞進行降解,慢性肝損傷時,肝間質(zhì)細胞增殖,HA的合成增加;肝竇內(nèi)皮細胞受損,攝取分解HA功能降低;并且肝組織纖維化時肝內(nèi)有不同程度的血流紊亂,門靜脈分流增加,也減少了竇內(nèi)皮細胞對HA的攝取分解,導(dǎo)致血清HA升高,是反映肝纖維化的重要指標[7]。在健康人群中,TBA值上下波動在均值的54%以內(nèi),ChE上下波動在均值的17%以內(nèi)[5],HA上下波動在均值的46%以內(nèi)[7]。本實驗中獼猴感染后與感染前相比,TBA增高3.4倍,ChE降低25%,HA增高88%。由于缺乏獼猴血清TBA、ChE和HA正常值的資料,難以根據(jù)這三項指標來判斷該獼猴肝臟代償功能是否異常,然而這三項指標的變化提示肝臟ChE合成、對膽汁酸重吸收的減少和對HA攝取分解能力的降低,豬囊尾蚴在獼猴肝臟的寄生已導(dǎo)致肝臟的損傷。

超聲檢查顯示獼猴肝臟病灶多為不均勻低回聲,其壁上有強回聲伴后方聲影,考慮為感染后組織自身修復(fù)過程中纖維組織增生,致聲阻抗差增大,從而使回聲增強,并伴后方聲衰減。病灶內(nèi)CDFI檢查無血流信號,提示肝囊蟲病病變多為少供血的病變。本文的結(jié)果表明,超聲顯像有很高的軟組織分辨力,能靈敏地顯示出肝臟占位病變。但是,寄生蟲感染性病灶的聲像圖特征缺乏特異性,需要進行超聲引導(dǎo)下穿刺活檢方能鑒別良惡性病變和肝寄生蟲感染性病變[8],若要確診為何種寄生蟲感染,尚需結(jié)合臨床和流行病學資料以及進行相關(guān)的病原學、免疫學或分子生物學檢查。本實驗中受染獼猴肝臟的結(jié)節(jié)周圍可見嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤,可初步診斷為寄生蟲感染。免疫學診斷,即血清囊尾蚴IgG的ELISA檢測亦提示豬囊尾蚴的感染。

盡管肝臟具有較強的代償功能,但囊尾蚴的寄生和引起的炎癥反應(yīng)已經(jīng)導(dǎo)致了本實驗中獼猴肝臟的局灶性損傷,并對肝功能造成一定的影響,其危害應(yīng)引起關(guān)注,特別是在豬帶絳蟲和囊蟲病流行區(qū),許多誤食豬帶絳蟲蟲卵或感染豬帶絳蟲成蟲的人由于未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或皮下未見結(jié)節(jié)而忽視了感染的存在,農(nóng)村醫(yī)療條件的限制使已經(jīng)感染了豬囊尾蚴,肝臟已出現(xiàn)病變的患者未能得到及時診斷和治療。本文實驗結(jié)果表明,在豬囊蟲病和豬帶絳蟲病流行區(qū),血清豬囊尾蚴抗體檢測結(jié)合肝臟B超檢查,有助于發(fā)現(xiàn)肝囊蟲病患者。

[1]劉永杰,李慶章,郝艷紅.豬帶絳蟲囊尾蚴的發(fā)育過程及形態(tài)觀察[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2002,20(5)：305-307.

[2]李寶華,包懷恩,牟榮,等.豬帶絳蟲卵實驗感染家豬后囊尾蚴在家豬體內(nèi)發(fā)育的觀察[J].中國人獸共患病學報,2008,24(9)：803-806.

[3]王志鵬,李晨,劉振國,等.實驗用獼猴某些生理生化指標的測定[J].動物醫(yī)學進展,2005,26(8)：68-71.

[4]羅蓉,王偉,李卓成,等.12項肝酶學指標對肝病診斷的臨床價值研究[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2009,6(12)：936-940.

[5]李貴芳,譚文.血清總膽汁酸前清蛋白膽堿酯酶在肝臟疾病診斷中的應(yīng)用[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2009,6(4)：265-266.

[6]蘭鍵萍.總膽汁酸與膽堿酯酶檢測在慢性肝病中的臨床意義[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2009,30(11)：1337-1338.

[7]李繼紅,郝志州.慢性肝病患者血清肝纖維化指標測定的臨床意義[J].實用肝臟病雜志,2009,12(4)：280-281.

[8]董寶瑋,梁萍,蘇莉,等.超聲引導(dǎo)細針活檢對肝臟小占位病變的診斷價值[J].中國超聲醫(yī)學雜志,1994,10：16-19.