朊病毒治療候選藥物的研究進(jìn)展*

鐘正偉,宋有濤

2.遼寧省動(dòng)物資源與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng)110036;

3.承德石油高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)工程系

瘋牛病(BSE)、羊瘙癢癥(scrapie)、人庫(kù)魯病(kuru)和人克雅氏癥(CJD)等都是由朊病毒(prion)引起的一類具有高度傳染性和致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。研究表明,細(xì)胞內(nèi)正常朊病毒(PrPC)是一種廣泛地表達(dá)于脊椎動(dòng)物細(xì)胞表面的內(nèi)源性糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白,在體內(nèi)以單體的形式出現(xiàn),不具有致病性。朊病毒一旦在某種條件下錯(cuò)誤折疊后形成致病性朊病毒(PrPSc),其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化,α螺旋降到30%,而β折疊的含量增至45%。同時(shí),致病性朊病毒能以自身為模板,誘導(dǎo)正常朊病毒向致病性構(gòu)象轉(zhuǎn)化,進(jìn)一步在分子間通過(guò)“交聯(lián)β折疊片”聚集,形成淀粉狀纖維的有毒片斷,最終誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺死腦神經(jīng)細(xì)胞而導(dǎo)致一系列致死性癥狀[2-3]。

由于朊病毒的分子致病機(jī)理的復(fù)雜性,迄今針對(duì)瘋牛病等朊病毒疾病仍然沒(méi)有研發(fā)出特效的治療藥物和治療辦法,近年來(lái)有關(guān)抗朊病毒藥物的篩選是國(guó)際上生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)。特別是在美國(guó)和歐洲,研究者在動(dòng)物、細(xì)胞和分子水平建立了一系列藥物篩選模型來(lái)篩選治療朊病毒疾病的候選藥物,并取得了可喜的成果。本文就目前獲得的具有抗朊病毒效果的候選藥物進(jìn)行綜述,并按照候選藥物的結(jié)構(gòu)或功能特點(diǎn)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的分類,希望能對(duì)瘋牛病等朊病毒疾病的治療和藥物篩選提供新的思路和方向。

1 多糖類化合物

1.1 糖胺聚糖及其類似物糖胺聚糖是動(dòng)、植物,特別是高等動(dòng)物結(jié)締組織中的一類結(jié)構(gòu)多糖,它與核心蛋白共價(jià)連接成蛋白聚糖參與細(xì)胞粘附、遷移和增殖。糖胺聚糖包括硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸等。其中,硫酸乙酰肝素和肝素具有一定的抗凝血活性,肝素臨床上用作抗凝血酶Ⅲ的增強(qiáng)劑。研究表明,硫酸乙酰肝素和肝素在朊病毒感染的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(sc+-MNBs)中可減少PrPSc的聚集[4]。但值得注意的是,硫酸乙酰肝素在無(wú)細(xì)胞體系中促進(jìn)PrPC向PrPSc轉(zhuǎn)化,而且轉(zhuǎn)化活性高于硫酸角質(zhì)素和硫酸軟骨素[5]。據(jù)此,研究者推測(cè)糖胺聚糖可能直接影響PrPSc的形成：在無(wú)細(xì)胞體系中促進(jìn)PrPSc的生成,而在細(xì)胞環(huán)境中由于受到其他因素的影響反而抑制PrPSc的產(chǎn)生。

硫酸乙酰肝素類似物(HM)主要應(yīng)用于傷口愈合,其化學(xué)合成主要是利用不同比例的硫酸基團(tuán)、羧甲基和苯甲酰胺基團(tuán)修飾葡聚糖的羥基。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HM2602和HM5004(圖1)能夠減少朊病毒感染細(xì)胞內(nèi)PrPSc的聚集,而隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HM2602能夠使感染羊瘙癢癥倉(cāng)鼠的發(fā)病潛伏期增加14%,并且明顯降低羊瘙癢癥感染的小鼠脾臟內(nèi)PrPSc的水平。近期研究發(fā)現(xiàn)HM在羊瘙癢癥感染粒子(Chandler)感染的鼠神經(jīng)元細(xì)胞(ScGT1-7)中抑制PrPSc聚集的能力與其分子量大小和修飾基團(tuán)有關(guān),分子量越大,硫酸化程度越高,以及羧甲基比例越低都明顯地增加了HM的抗朊病毒效果[6]。雖然分子量增大不利于藥物穿透血腦屏障,但通過(guò)合理的基團(tuán)修飾后的HM有可能成為今后有效的抗朊病毒藥物之一。

圖1 硫酸乙酰肝素類似物的分子結(jié)構(gòu)

X代表苯環(huán),HM2602包含的硫酸基團(tuán)、羧甲基團(tuán)和苯甲酰胺基團(tuán)的比例為0.5∶0.8∶0.2;HM5004包含的硫酸基團(tuán)、羧甲基團(tuán)的比例為1.3∶0.5,不含苯甲酰胺基團(tuán)。

戊聚糖多硫酸酯(PPS)為糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)類似物,具有抗凝血與抗炎癥活性,臨床上用于治療動(dòng)物骨關(guān)節(jié)炎。研究發(fā)現(xiàn)PPS與硫酸乙酰肝素的功能相似,在朊病毒感染的細(xì)胞內(nèi)可降低PrPSc的水平,但是在無(wú)細(xì)胞體系中PPS卻加速PrPSc的形成[5]。此外,PPS也延長(zhǎng)了羊瘙癢癥感染小鼠的發(fā)病潛伏期,而且在人克雅氏癥感染的鹿細(xì)胞(MDB)中抑制PrPSc的聚集[7]。

硫酸葡聚糖 (DS)也是糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)類似物,早期研究認(rèn)為朊病毒發(fā)病機(jī)制和淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)(LPS)有關(guān),而DS可引起LPS的短期破壞,因此DS對(duì)嗜淋巴細(xì)胞朊病毒株感染的細(xì)胞效果尤為明顯,經(jīng)DS處理小鼠脾臟內(nèi)朊病毒后可明顯降低其傳染能力;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分子量為500kDa的DS(DS500)可以延遲腹膜內(nèi)感染朊病毒小鼠的發(fā)病期,也可延遲腦內(nèi)和腹膜內(nèi)感染朊病毒倉(cāng)鼠的發(fā)病期。另外,DS500可降低朊病毒感染細(xì)胞內(nèi)PrPSc的水平,但同時(shí)也引起未感染朊病毒細(xì)胞內(nèi)正常PrPC的減少[8],因此研究者推測(cè)DS500可能通過(guò)抑制PrPC的生成從而減少細(xì)胞內(nèi) PrPSc的水平。

1.2 環(huán)糊精 環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡糖,一般由6～8個(gè)葡糖糖單位通過(guò)α-1,4糖苷鍵連接而成,被作為穩(wěn)定劑、抗氧化劑、抗光解劑、乳化劑和增溶劑廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中。β-環(huán)糊精(圖2)具有類似分子伴侶的性質(zhì),可以幫助蛋白質(zhì)折疊,阻止蛋白質(zhì)的聚集。最近研究發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精在羊瘙癢癥感染的小鼠N2a22L20細(xì)胞中具有清除PrPSc的能力,尤其是β-環(huán)糊精被硫酸化修飾后其抗朊病毒活性提高了31倍[9]。

圖2 β-環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)箭頭所示為硫酸化修飾位置

2 雜環(huán)化合物

2.1 卟啉及其金屬配合物 卟啉及其金屬配合物是一類廣泛存在于自然界并具有特殊生理活性的化合物,例如進(jìn)行生物體內(nèi)氧氣傳輸?shù)难t素和實(shí)現(xiàn)光合作用中能量轉(zhuǎn)移的葉綠素。卟啉臨床上主要用于檢測(cè)和治療癌癥。早期研究發(fā)現(xiàn)一些卟啉、酞菁(卟啉的結(jié)構(gòu)類似物)及其金屬配合物在羊瘙癢癥感染粒子(RML)感染的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(ScN2a)中降低PrPSc的水平,而且在無(wú)細(xì)胞體系中阻止PrPSc的聚集,其中三種最有效的化合物是四磺酸基酞菁(PcTS)(圖 3A)、2,4-二乙二醇基-次卟啉鐵(DPG2-Fe3+)(圖 3B)和四吡啶基卟啉鐵(TMPP-Fe3+)(圖3C)。最近有研究表明四苯基卟吩(TPP)、四苯甲酸基卟吩(TCPP)、四苯磺酸基卟吩(TPPS)、四吡啶基卟吩(TMPP)、四苯甲酸基卟啉錳(Mn3+-TCPP)和四吡啶基卟啉錳(Mn3+-TMPP)(圖3C)等在兩種細(xì)胞模型ScN2a與F3(羊瘙癢癥感染粒子Fukuoka-1感染的小鼠N2a#58細(xì)胞)中抑制PrPSc的聚集,其中作用效果最好的是Mn3+-TMPP(IC50分別為 5nM 與 40nM)[10]。另外,四苯磺酸基卟啉銦(In3+-TSP),在人克雅氏癥感染的鹿細(xì)胞中可以抑制PrPSc聚集[7],而四(4-N,N,N-三甲基)苯基卟啉鐵(Fe3+-TAP)可以4倍地延長(zhǎng)腹膜內(nèi)羊瘙癢癥感染粒子(263K)感染的小鼠(tg7)的存活時(shí)間[11]。

圖3 卟啉及其金屬配合物的分子結(jié)構(gòu)

2.2 氨噻唑化合物氨噻唑化合物屬于甲狀腺激素類藥物或抗甲狀腺藥物,近來(lái)還被用作腺苷受體拮抗劑。新近研究表明,五種2-氨噻唑化合物(圖4)可能通過(guò)抑制PrPSc的形成從而降低ScN2a細(xì)胞中PrPSc的水平[12]。

2.3 吩噻嗪衍生物和吖啶衍生物 吩噻嗪于1883年合成,曾用作驅(qū)蟲藥,現(xiàn)在其衍生物臨床上作為抗精神病藥(氯丙嗪)和抗組胺藥(異丙嗪)被廣泛使用。吖啶衍生物奎納克林(又稱為阿的平)是最早合成的抗瘧疾藥,由于副作用較大現(xiàn)已停用。2001年P(guān)rusiner研究小組發(fā)現(xiàn)一系列吖啶和吩噻嗪衍生物在ScN2a細(xì)胞中具有不同程度地抑制PrPSc聚集或清除PrPSc的作用,其中最有效的是奎納克林(IC50為 0.3μ mol/L)和氯丙嗪(IC50為 3μ mol/L)。隨后的深入研究表明,吩噻嗪衍生物如氯丙嗪、丙嗪、異丙嗪、硫利達(dá)嗪(thioridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)和吩噻嗪結(jié)構(gòu)類似物氨砜噻噸(thiothixene)在羊瘙癢癥感染粒子(RML)與(22L)感染的小鼠N2a細(xì)胞中均可抑制PrPSc的積累。由于吩噻嗪衍生物和吖啶衍生物可作為藥物被使用,因而認(rèn)為其可能是最有潛力的抗朊病毒候選藥物,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)奎納克林雖然在無(wú)細(xì)胞體系和細(xì)胞模型中都具有抑制PrPSc聚集的作用,但動(dòng)物模型研究結(jié)果顯示奎納克林沒(méi)有延長(zhǎng)腦和腹膜等部位感染朊病毒小鼠的發(fā)病潛伏期。令人驚訝的是,最近的研究結(jié)果還顯示持續(xù)地給患病小鼠注射奎納克林反而會(huì)導(dǎo)致抗藥性朊病毒聚集體的產(chǎn)生,這種現(xiàn)象可能有助于解釋動(dòng)物模型中奎納克林等藥物抗朊病毒作用不明顯的原因。

2.4 菲啶衍生物 2003年法國(guó)Blondel實(shí)驗(yàn)室研究了2500多種化合物的抗酵母朊病毒[PSI+]和[URE3]的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菲啶、6-氨基菲啶(6AP)、8-氯-6-氨基菲啶(6A-8CP)、8-三氟甲基-6-氨基菲啶(6A-8tFP)和一類稱為kastellpaolitines(KP)(圖5)的菲啶衍生物具有很強(qiáng)的抗酵母朊病毒活性,利用ScN2a細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)KP和6AP具有細(xì)胞內(nèi)清除PrPSc的活性[15]。最近的研究表明,抗高血壓藥胍那芐(GA)(圖5)具有抗酵母朊病毒活性,而且還具有在綿羊瘙癢癥感染粒子(127S)感染的小鼠MovS6細(xì)胞中清除 PrPSc的能力(EC50為7.5μ mol/L),進(jìn)一步研究GA的鹵代物發(fā)現(xiàn)其氯代物顯著提高了抗酵母朊病毒和細(xì)胞內(nèi)清除PrPSc的活性。此外,動(dòng)物模型研究顯示GA明顯延長(zhǎng)了127S感染的轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg338)的存活時(shí)間[16]。隨后Blondel等利用親和吸附法研究發(fā)現(xiàn)在酵母中核糖體可能是GA與6AP的作用靶點(diǎn),GA與6AP不影響核糖體的蛋白合成活性,但可能強(qiáng)烈且專一地抑制核糖體RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊活性[15]。

圖4 五種2-氨噻唑化合物的分子結(jié)構(gòu)

圖5 菲啶衍生物和胍那芐的分子結(jié)構(gòu)A ：菲啶;B：6-氨基菲啶;C：8-氯-6-氨基菲啶;D：8-三氟甲基-6-氨基菲啶;E：KP1;F ：KP2;G：KP3;H：KP4;I：KP5;J：胍那芐。

2.5 生育酚及衍生物 生育酚屬于維生素E類,是苯駢二氫吡喃衍生物,具有抗氧化活性,臨床上具有抗不育作用。最近,Muyrers等研究發(fā)現(xiàn)α-生育酚 、γ-生育酚 、δ-生 育酚和 α-生育酚的三 種衍生物(α-生育酚丁二酸酯、α-生育酚醋酸酯和α-生育酚煙酸酯)在ScN2a細(xì)胞中均顯示了一定的抗朊病毒作用,其中α-生育酚丁二酸酯的抗朊病毒作用最強(qiáng)(EC50為 7μ mol/L)[17]。

2.6 其他雜環(huán)化合物 2005年Bertsch等將重組鼠朊病毒用熒光標(biāo)記,采用熒光相關(guān)光譜(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)技術(shù)通過(guò)96孔板篩選影響 PrPC向 PrPSc轉(zhuǎn)化的藥物,在 DI-VERSet1化合物庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了80種抑制PrPSc形成的化合物,而且實(shí)驗(yàn)證實(shí) 6種化合物(293G02、309F02、305E04 、297F03 、313B02 和 260D06)(圖 6)在羊瘙癢癥感染的N2a細(xì)胞中抑制致病性朊病毒的傳播,其中四種化合物(293G02、309F02、305E04、297F03)都含有一個(gè)共同的核心結(jié)構(gòu)N′-苯亞甲基-苯并酰肼(N′-benzylidene-benzohydrazide)[18]。

圖6 雜環(huán)化合物 293G02、309F02、305E04、297F03、313B02和260D06的分子結(jié)構(gòu)

最近,Hosokawa-Muto等利用AutoDock軟件設(shè)計(jì)的虛擬模型在ZINC化合物庫(kù)中研究了小分子化合物與朊蛋白向致病結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過(guò)程的相互關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)205種化合物影響了朊蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。隨后利用Fukuoka-1感染的小鼠GT1-7細(xì)胞研究了以上 205種化合物的抗朊病毒活性,實(shí)驗(yàn)證實(shí)GN8 、GFP23、GFP07、GJP45 和 GJP49(圖 7)等 24種雜環(huán)化合物具有一定的抑制 PrPSc聚集的作用[19]。

圖7 雜環(huán)化合物GN8、GFP23、GFP07、GJP45和GJP49的分子結(jié)構(gòu)

剛果紅(CR)是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)常見的細(xì)胞標(biāo)記染料,廣泛地應(yīng)用于淀粉樣腦病的病理學(xué)切片染色。CR是目前發(fā)現(xiàn)的在多種研究模型(羊瘙癢癥感染的細(xì)胞模型、無(wú)細(xì)胞體系和腹腔或腦內(nèi)感染朊病毒的倉(cāng)鼠)中具有抗朊病毒效果的化合物。雖然CR存在著細(xì)胞毒性和不能通過(guò)血腦屏障,限制了其臨床用途,但促進(jìn)了其他淀粉樣纖維染料和CR類似物的抗朊病毒作用研究。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示,埃文斯紅、臺(tái)盼藍(lán)、天狼星紅、硫磺素S和櫻草靈等淀粉樣纖維染料在無(wú)細(xì)胞體系中具有很強(qiáng)的抑制PrPSc聚集的效果,但在朊病毒感染細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有抗朊病毒作用。舒拉明(Suramin)結(jié)構(gòu)同源于CR,臨床上用于治療錐蟲病。在朊病毒感染的小鼠細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其通過(guò)降低細(xì)胞正常PrPC的表達(dá)水平從而減少PrPSc的積累;在無(wú)細(xì)胞體系中舒拉明卻導(dǎo)致重組PrP的聚集[20]。

姜黃素是姜黃根的主要成分,結(jié)構(gòu)類似于剛果紅,是一種非毒性的抗氧化劑。姜黃素可減少阿爾茨海默癥小鼠體內(nèi)β肽的聚集,在無(wú)細(xì)胞體系中能抑制PrPSc的形成,并且在RM L感染的N2a細(xì)胞中有效地抑制PrPSc的聚集(IC50為10nmol/L),但在22L感染的鼠N2a細(xì)胞或綿羊細(xì)胞模型中無(wú)明顯抗朊病毒效果[21]。

阿司咪唑(astemizole)和特非那定(terfenadine)是兩種常見的抗組胺藥,屬于組胺H1受體拮抗劑。研究表明阿司咪唑和特非那定在 RML與22L感染的鼠N2a細(xì)胞中均可以抑制PrPSc的積累[13]。遺憾的是,這兩種藥物穿過(guò)血腦屏障的能力不強(qiáng),從而限制了其應(yīng)用于治療傳染性海綿樣腦病。

3 抗生素類化合物

3.1 兩性霉素B(AmB) 兩性霉素B是來(lái)源于鏈霉菌屬的抗真菌抗生素,其抑菌機(jī)理是通過(guò)結(jié)合真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇從而損傷膜的通透性。早期的研究發(fā)現(xiàn)AmB(圖8)可以延遲人克雅氏癥感染的非洲綠猴的發(fā)病時(shí)間,也可以推遲羊瘙癢癥感染的倉(cāng)鼠與小鼠的發(fā)病期,即使在小鼠感染后期,AmB仍然可以延長(zhǎng)其存活時(shí)間。最近的研究結(jié)果顯示,AmB的結(jié)構(gòu)類似物16B和3種新的結(jié)構(gòu)類似物(16-19B、8-16A、Tet-aglycone)具有在 22L感染的小鼠N2a22L20細(xì)胞中清除PrPSc的能力,其中3種新結(jié)構(gòu)類似物的抗朊病毒活性強(qiáng)于AmB,而16B的抗朊病毒活性與AmB相當(dāng),與AmB相比,兩性霉素A(AmA)基本不具有抗朊病毒活性[22](圖8)。

3.2 四環(huán)類抗生素 四環(huán)類抗生素是一類廣譜抑菌劑,其藥理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。研究發(fā)現(xiàn),鹽酸四環(huán)素和鹽酸多西環(huán)素明顯地降低新克雅氏癥患者和瘋牛病病牛腦勻漿內(nèi)PrPSc的含量,而且患瘙癢癥羊的腦勻漿經(jīng)鹽酸四環(huán)素和鹽酸多西環(huán)素預(yù)處理24 h后,可以降低其再感染敘利亞倉(cāng)鼠的能力。最近研究表明,經(jīng)皮下注射給藥后,鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素和鹽酸米諾環(huán)素都可以延長(zhǎng)羊瘙癢癥感染的敘利亞倉(cāng)鼠的存活時(shí)間;但經(jīng)腦部注射脂質(zhì)體包埋的藥物后,僅鹽酸多西環(huán)素和鹽酸米諾環(huán)素可有效地增加羊瘙癢癥感染的倉(cāng)鼠的半數(shù)生存期[23]。

圖8 兩性霉素B及其結(jié)構(gòu)類似物的分子結(jié)構(gòu)

4 其他化合物

早期研究發(fā)現(xiàn)分支聚胺(branched polyamines)在羊瘙癢癥感染的ScN2a細(xì)胞模型中可以清除PrPSc。遺憾的是,分支聚胺的細(xì)胞毒性較強(qiáng),限制了其臨床用途。新近研究顯示分支聚乙烯亞胺和分支聚乙二胺經(jīng)過(guò)季銨化作用后,明顯降低了其細(xì)胞毒性,而且對(duì)比未季銨化的分支聚胺,其抗朊病毒效果未發(fā)生明顯變化[24]。綠茶提取物中的主要多酚類物質(zhì)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)在ScN2a細(xì)胞中顯著地清除 PrPSc,但強(qiáng)烈地干擾未感染細(xì)胞中正常PrPC的表達(dá)[25]。研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)EGCG和GCG將天然伸展的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)槿ノ蹌┎蝗艿漠悩?gòu)體,異構(gòu)體在細(xì)胞內(nèi)被迅速降解,從而保護(hù)細(xì)胞不易被PrPSc感染。另外,半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64d能夠選擇透過(guò)細(xì)胞膜導(dǎo)致ScN2a細(xì)胞中PrPSc降低,而且不影響PrPC的正常代謝[26]。需要注意的是,Fukuuchi等研究卟啉化合物的抗朊病毒作用時(shí)發(fā)現(xiàn)三種銅螯合劑——新亞銅試劑(Neocuproine)、浴銅靈(Bathocuproine)和聯(lián)喹啉(2,2′-biquinoline,BQ)在ScN2a與F3細(xì)胞中對(duì)PrPSc聚集體形成具有抑制作用[10]。最近的研究成果顯示 BQ導(dǎo)致ScN2a細(xì)胞中PrP的總量減少和抑制PrP的mRNA的表達(dá)水平,但不影響未感染的 N2a細(xì)胞中PrP的總量[27],因此研究者認(rèn)為BQ抑制PrPSc聚集體形成的原因是降低了感染細(xì)胞中PrP的總量。

5 抗 體

除了常規(guī)的瘋牛病治療藥物的研發(fā),一個(gè)不容忽視的是,近年來(lái)對(duì)具有抗朊病毒效果的抗體研究發(fā)展迅速。2001年Enari等研究發(fā)現(xiàn)單克隆抗體6H4(抗體識(shí)別表位為鼠PrP第144-152位殘基)在感染羊瘙癢癥的N2a細(xì)胞模型中顯著地抑制PrPSc的聚 集(IC50為 2.5 μ g/mL)。2004 年Beringue等利用穩(wěn)定表達(dá)牛PrP的朊病毒感染兔Rov細(xì)胞,證實(shí)了基因重組小鼠來(lái)源的抗人α或β構(gòu)象 PrP 抗體 ICSM18、ICSM19、ICSM35 、ICSM37和ICSM42在低濃度下能有效地抑制PrPSc的聚集,作用3周后,ICSM35、ICSM37和ICSM42能夠500～1 000倍地降低PrPSc的水平,ICSM18和ICSM19能夠100倍地降低PrPSc含量,進(jìn)一步研究證實(shí)效果最明顯的三種抗體為抗人β構(gòu)象的PrP抗體,識(shí)別表位均為 96-109位殘基[28]。最近的研究結(jié)果顯示,采用人PrP肽段、牛鼠重組PrP和羊瘙癢癥纖維(SAF)免疫小鼠所獲得的145種單克隆抗體中,有37種抗體能不同程度地降低 N2a細(xì)胞(鼠源PrPSc感染的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)和Rov9細(xì)胞(羊PrPSc感染的兔上皮細(xì)胞)中PrPSc的水平[29]。盡管采用不同免疫原獲得的抗體在不同的細(xì)胞模型中顯示了很強(qiáng)的清除PrPSc的能力,但由于獲得的全長(zhǎng)抗體分子量較大不利于其穿透血腦屏障因而限制了其在病灶部位發(fā)揮作用。因此減小抗體的分子量大小或研究易穿透血腦屏障的抗體越來(lái)越受到重視。最近研究發(fā)現(xiàn)一種外源表達(dá)的單鏈抗體D18scFv(由抗牛鼠重組PrP抗體D18的VH+VL組成)與ScGT1細(xì)胞共培養(yǎng)一周后能降低細(xì)胞中PrPSc含量的95%左右[30]。更令人興奮的是,研究者將D18scFv的cDNA分別克隆在慢病毒(Lentivirus)與腺病毒(AAV2)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體上,然后轉(zhuǎn)染ScN2a與ScGT1細(xì)胞,并采用免疫印跡技術(shù)分別檢測(cè)兩種細(xì)胞中PrPSc的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)一周后,慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染體系導(dǎo)致ScN2a與ScGT1細(xì)胞中PrPSc的含量分別減少了90%和80%,腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染體系也導(dǎo)致ScN2a與ScGT1細(xì)胞中PrPSc的含量分別減少了20%和5%。雖然這種基于基因治療的由病毒載體介導(dǎo)的抗體免疫法其安全性還有待進(jìn)一步研究,但我們有理由相信這可能是今后治療朊病毒疾病的最佳途徑之一。另外,新近研究發(fā)現(xiàn),借助噬菌體展示載體和真核分泌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的scFvT2抗體(由抗重組鼠PrP121-231抗體T2的VH+VL組成)表達(dá)系統(tǒng)pSecscFvT2,轉(zhuǎn)染ScN2a細(xì)胞培養(yǎng)4d后,可明顯地降低PrPSc的水平[31]。此外,該研究領(lǐng)域一個(gè)突破性的進(jìn)展是關(guān)于來(lái)源于駱駝的抗PrP抗體PrioV3的研究：抗體PrioV3在ScN2a細(xì)胞可以有效地抑制PrPSc的聚集,它不僅比抗體ICSM35具有更小的細(xì)胞毒性,更重要的是,抗體PrioV3可以穿透血腦屏障,其原因可能是駱駝產(chǎn)生的抗體對(duì)比常規(guī)來(lái)源的四鏈抗體僅由兩條重鏈組成,而且缺少重鏈的CH1區(qū)[32]。

6 結(jié) 語(yǔ)

朊病毒治療候選藥物的研究是一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域,研究者們利用無(wú)細(xì)胞體系、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、和模式動(dòng)物設(shè)計(jì)了一系列的抗朊病毒藥物篩選模型,并利用這些模型篩選獲得了大量有潛力的抗朊病毒候選藥物(表1)。

表1 目前抗朊病毒候選藥物的作用效果和可能機(jī)制

續(xù)表

但需要指出的是,許多候選藥物在模式動(dòng)物中的抗朊病毒效果并不十分理想。主要原因是朊病毒疾病主要發(fā)生在腦部,而常規(guī)候選藥物難以穿透血腦屏障發(fā)揮作用;其次有些候選藥物的細(xì)胞毒性較大,限制了其臨床用途;再次,不同種屬的朊病毒疾病的差異較大,也導(dǎo)致了單一的藥物難以發(fā)揮廣泛地治愈朊病毒疾病的作用。因此,對(duì)當(dāng)前候選藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,以期提高療效、降低毒性和增強(qiáng)穿透血腦屏障的能力,可能是今后抗朊病毒藥物研究的一個(gè)方向。另外,尋找新型抗朊病毒候選藥物,以期獲得抗朊病毒效果更佳的候選藥物也應(yīng)該成為今后研究的重點(diǎn),如本實(shí)驗(yàn)室借助傳統(tǒng)中草藥多途徑、多方式、多靶點(diǎn)的作用優(yōu)勢(shì),正在進(jìn)行的從中草藥中篩選抗朊病毒候選藥物的研究?？傊?隨著朊病毒疾病發(fā)病分子機(jī)制研究的進(jìn)一步深入,抗朊病毒藥物研發(fā)的進(jìn)一步發(fā)展,相信在不久的將來(lái)首個(gè)投入臨床使用的朊病毒治療藥物即將誕生。

[1]Prusiner S B,Scott M R,Dearmond S J,et al.Prion protein biology[J].Cell,1998,93(3)：337-348.

[2]張杰,路偉,劉永生.細(xì)胞型朊蛋白(PrPC)研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2008,24(1)：83-86.

[3]Nelson R,Sawaya M R,Balbirnie M,et al.Structure of the cross-beta spine of amy loid-like fibrils[J].Nature,2005,435(7043)：773-778.

[4]Caughey B,Brown K,Raymond G J,et al.Binding of the protease-sensitive form of PrP(prion protein)to sulfated glycosaminoglycan and congo red[corrected][J].J Virol,1994,68(4)：2135-2141.

[5]Wong C,Xiong L W,Horiuchi M,et al.Sulfated glycans and elevated temperature stimulate PrPSc-dependent cell-free formation of protease-resistant prion protein[J].EMBO J,2001,20(3)：377-386.

[6]Ouidja M O,Petit E,Kerros M E,et al.Structure activity studies of heparan mimetic poly anions for anti-prion therapies[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,363：95-100.

[7]Raymond G J,Olsen E A,Lee K S,et al.Inhibition of proteaseresistant prion protein formation in a transformed deer cell line infected with chronic wasting disease[J].J Virol,2006,80(2)：596-604.

[8]Shy ng S L,Lehmann S,Moulder K L,et al.Sulfated glycans stimulate endocytosis of the cellular isoform of the prion protein,PrPC,in cultured cells[J].J Biol Chem,1995,270(50)：30221-30229.

[9]Mcevoy K,Mcmahon H E.Antiprion action of new cyclodex trin analogues[J].Biochim Biophys Acta,2009,1790(10)：1382-1386.

[10]Fukuuchi T,Doh-Ura K,Yoshihara S,et al.Metal complexes with superoxide dismutase-like activity as candidates for antiprion drug[J].Bioorg Med Chem Lett,2006,16(23)：5982-5987.

[11]Kocisko D A,Caughey B.M efloquine,an antimalaria drug with antiprion activity in vitro,lacks activity in vivo[J].J Virol,2006,80(2)：1044-1046.

[12]Ghaemmaghami S,May B C,Renslo A R,et al.Discovery of 2-aminothiazoles as potent antiprion compounds[J].J Virol,2010,84(7)：3408-3412.

[13]Kocisko D A,Baron G,Rubenstein R,et al.New Inhibitors of Scrapie-Associated Prion Protein Formation in a Library of 2,000 Drugs and Natural Products[J].J Virol,2003,77(19)：10288-10294.

[14]Ghaemmaghami S,Ahn M,Lessard P,et al.Continuous quinacrine treatment results in the fo rmation of drug-resistant prions[J].PLoS Pathog,2009,5(11)：e1000673.

[15]Tribouillard-Tanvier D,Dos R S,Gug F,et al.Protein folding activity of ribosomal RNA is a selective target of two unrelated antiprion drugs[J].PLoS One,2008,3(5)：e2174.

[16]Tribouillard-Tanvier D,Beringue V,Desban N,et al.Antihypertensive drug guanabenz is active in vivo against both yeast and mammalian prions[J].PLoS One,2008,3(4)：e1981.

[17]Muyrers J,Klingenstein R,Stitz L,et al.Structure activity relationship of tocopherol derivatives suggesting a novel non-antioxidant mechanism in antiprion potency[J].Neurosci Lett,2010,469：122-126.

[18]Bertsch U,Winklhofer K F,Hirschberger T,et al.Sy stematic identification of antiprion drugs by high-throughput screening based on scanning for intensely fluorescent targets[J].J Virol,2005,79(12)：7785-7791.

[19]Hosokawa-Muto J,Kamatari Y O,Nakamura H K,et al.Variety of antiprion compounds discovered through an in silico screen based on cellular-form prion protein structure：Correlation between antiprion activity and binding affinity[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(2)：765-771.

[20]Sim V L,Caughey B.Recent advances in prion chemotherapeutics[J].Infect Disord Drug Targets,2009,9(1)：81-91.

[21]Kocisko A D,Engel A L,Harbuck K,et al.Comparison of protease-resistant prion protein inhibitors in cell cultures infected with two strains of mouse and sheep scrapie[J].Neurosci Lett,2005,355：106-111.

[22]Soler L,Caffrey P,Mcmahon H E.Effects of new amphotericin analogues on the scrapie isoform of the prion protein[J].Biochim Biophys Acta,2008,1780(10)：1162-1167.

[23]Luigi A D,Colombo L,Diomede L,et al.The efficacy of tetracyclines in peripheral and intracerebral prion infection[J].PLoS One,2008,3(3)：e1888.

[24]Lim Y B,May s C E,Kim Y,et al.The inhibition of prions through blocking prion conversion by permanently charged branched polyamines of low cytotoxicity[J].Biomaterials,2010,31(8)：2025-2033.

[25]Rambold A S,Miesbauer M,Olschew ski D,et al.green tea eatract interfere with the stress-protective activity of PrPC and the formation ofPrPSc[J].J Neurochem,2008,107：218-229.

[26]Doh-Ura K,Iwaki T,Caughey B.Lysosomotropic agents and cysteine protease inhibitors inhibit scrapie-associated prion protein accumulation[J].J Virol,2000,74(10)：4894-4897.

[27]Fukuuchi T,Okuda K,Yoshihara S,et al.A Candidate Anti-Prion Disease Agent,2,2-Biquinoline Decreases Expression of Prion P rotein and mRNA in Prion-Infected Cells[J].J Health Sci,2009,55(4)：586-592.

[28]Beringue V,Vilette D,Mallinson G,et al.P rPSc binding antibodies are potent inhibitors of prion replication in cell lines[J].J Biol Chem,2004,279(38)：39671-39676.

[29]Feraudet C,M orel N,Simon S,et al.Screening of 145 anti-PrP monoclonal antibodies for their capacity to inhibit PrPSc replication in infected cells[J].J Biol Chem,2005,280(12)：11247-11258.

[30]Campana V,Zentilin L,Mirabile I,et al.Development of antibody fragments for immunotherapy of prion diseases[J].Biochem J,2009,418(3)：507-515.

[31]Shimizu Y,Kaku-Ushiki Y,Iwamaru Y,et al.A novel antiprion protein monoclonal antibody and its single-chain fragment variable derivative with ability to inhibit abnormal prion protein accumulation in cultured cells[J].Microbiol Immunol,2010,54：112-121.

[32]Jones D R,T aylo r W R,Bate C,et al.A Camelid Anti-PrP Antibody Abrogates PrPSc Replication in Prion-Permissive Neuroblastoma Cell Lines[J].P LoS One,2009,5(3)：e9804.