白腐真菌Hyprocrea lixii AH的產(chǎn)酶特性研究

石開儀，許 寧，陶秀祥，洪芬芬

(1.中國礦業(yè)大學(xué)煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室 ，江蘇徐州 221008;2.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221008;3.宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，安徽宿州 234000)

·開發(fā)與研究·

白腐真菌Hyprocrea lixii AH的產(chǎn)酶特性研究

石開儀1，2，許 寧3，陶秀祥1，2，洪芬芬1，2

(1.中國礦業(yè)大學(xué)煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室 ，江蘇徐州 221008;2.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221008;3.宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，安徽宿州 234000)

為了確定白腐真菌(H.lixii AH)在SMA培養(yǎng)基中的最佳產(chǎn)酶條件，利用正交試驗研究了藜蘆醇、Cu2+以及表面活性劑(吐溫)的用量對真菌H.lixii AH生長和產(chǎn)酶的影響。發(fā)現(xiàn)吐溫80和低濃度Cu2+對真菌的生長有促進作用，過氧化物酶和多酚氧化酶受Cu2+影響最大，優(yōu)選濃度均是0.2g/L。LiP、MnP和Lac受吐溫的影響較顯著，添加吐溫60后，LiP和MnP活性分別提高了11.7%和38%，而Lac有所下降。

白腐真菌;哈茨木霉;產(chǎn)酶;活性;正交試驗

Abstract:In ordor to determine the optimum enzyme production condition of white rot fungus hyprocrea lixii AH in SMA medium，the effect of the amount of veratryl alcohol，Cu2+and surfactunt to H.lixii AH growthing and its enzyme production are studied by orthogonal experiment.The result shows，the tween 80and lower concentration Cu2+has promoting effect to fungus growthing，the effect of Cu2+to peroxidase and polyphenol oxidase are maximum，the optimal selecting concentration of Cu2+all is 0.2g/L.The effect of tween to LiP，MnP and Lac is significant，after adding tween 80，the activity of LiP and MnP improve respectively 11.7%and 38% ，but the activity of Lac decreases somewhat.

Key words:white rot fungus;enzyme production;activity;orthogonal experiment;hamington baraki enayme

白腐真菌因其具有降解各種不同結(jié)構(gòu)的天然及合成化學(xué)物質(zhì)的能力，因而吸引國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［1］。白腐真菌在環(huán)境保護中，如造紙廢水處理［2］、土壤污染治理、重金屬污染治理［3］等方面，均得到很好的應(yīng)用。白腐真菌對大分子化合物的降解主要是酶起作用［4－5］，其中木質(zhì)素降解酶系［6］起著關(guān)鍵性作用。本文主要研究本實驗室篩選的一株具有煤炭降解能力的白腐真菌的產(chǎn)酶特性，主要研究了酶激活劑(黎蘆醇、Cu2+)和表面活性劑(吐溫)對產(chǎn)酶的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

采用實驗室篩選并保存的白腐真菌，命名為真菌Hyprocrea.lixii AH，通過16s rDNA測定屬于哈茨木霉。實驗中采用SMA培養(yǎng)基，其組成為:麥芽糖40g，蛋白胨 10g，瓊脂 20g，水 1000mL，自然pH值。

1.2 正交試驗設(shè)計

為提高真菌酶活性，考察了藜蘆醇、Cu2+以及表面活性劑對真菌H.lixii AH產(chǎn)酶和煤炭降解的影響。正交試驗因素、水平如表1所示。

表1 產(chǎn)酶正交試驗因素水平表

采用3因素3水平正交表。試驗中用兩組平行樣，分別標(biāo)號 1、2、3、4、5、6、7、8、9。試驗從接種開始每隔一定時間分別測量各組的菌落大小以判斷各組生長情況，再過1～2d開始測酶活。

1.3 酶活性的測定

過氧化物酶和多酚氧化酶活性的測定按照文獻進行，木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的活性按照文獻中的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑對真菌生長的影響

首先考察了不同濃度的藜蘆醇和銅離子以及不同表面活性劑對真菌生長和產(chǎn)酶的影響。由菌絲生長圖(圖1)可知，3號生長最快，4號和8號生長最慢。與圖2未優(yōu)化前的菌體生長比較可以看出，3號和6號比未優(yōu)化前生長要快。3號和6號都加入的是吐溫80，9號同樣加吐溫80，也生長比較快。由此可推測，吐溫80可以促進真菌H.lixii AH生長。生長較慢的幾組試驗的Cu2+濃度都較大，可能當(dāng)Cu2+濃度大于0.2g/L時，菌體生長受到抑制。

圖1 優(yōu)化培養(yǎng)基中真菌H.lixii AH的生長

圖2 未優(yōu)化培養(yǎng)基中菌絲生長速度

2.2 酶活性的變化

根據(jù)正交試驗表1進行試驗，測定各酶活性，結(jié)果如表2所示。

表2 SMA優(yōu)化培養(yǎng)基中的酶活性 U

2.2.1 以過氧化物酶為指標(biāo)的正交試驗分析

以過氧化物酶的活性為指標(biāo)的分析表如表3和表4所列。

表3 以過氧化物酶為指標(biāo)的直觀分析表

表4 以過氧化物酶為指標(biāo)的方差分析表

由表4可以看出，Cu2+對真菌H.lixii AH的過氧化物酶活性的影響最為顯著，吐溫的影響較顯著，藜蘆醇影響最小。直觀分析(表3)表明，A因素(藜蘆醇)以第一水平、B因素(吐溫)以第一水平、C因素(Cu2+)以第一水平最好。即當(dāng)藜蘆醇為1mmol/L，吐溫20，Cu2+濃度為0.2g/L 時，SMA 培養(yǎng)基的過氧化物酶的活性最大，達1377U，比未添加試劑的688.5U的提高了一倍。

2.2.2 以多酚氧化酶為指標(biāo)的正交試驗分析

以多酚氧化酶為指標(biāo)的正交分析表如表5和表6所示。由表6可以看出，H.lixii AH的多酚氧化酶活性也是受Cu2+的影響最為顯著，而藜蘆醇和吐溫的影響都一般。直觀分析(表5)表明，A因素(藜蘆醇)以第二水平、B因素(吐溫)以第一水平、C因素(Cu2+)以第一水平最好。即當(dāng)藜蘆醇為3mmol/L，吐溫20，Cu2+用量為0.2g/L 時，SMA 培養(yǎng)基中的多酚氧化酶活最大，為324U，然而卻比未添加上述試劑的364.5U有所降低。2.2.3 以LiP為指標(biāo)的正交試驗分析

表5 以多酚氧化酶為指標(biāo)的直觀分析表

表6 以多酚氧化酶為指標(biāo)的方差分析表

以LiP為指標(biāo)的正交試驗分析如表7和表8所示。

表7 以LiP為指標(biāo)的直觀分析表

表8 以多酚氧化酶為指標(biāo)的方差分析表

由表8可知，藜蘆醇的濃度H.lixii AH分泌的LiP活性的影響最為顯著，吐溫次之，Cu2+濃度影響最小。由表7的直觀分析表明，藜蘆醇濃度以第三水平、吐溫以第二水平、Cu2+濃度以第一水平或第三水平最好。即當(dāng)藜蘆醇為5mmol/L，吐溫60，Cu2+用量為0.2g/L或0.08g/L時即低濃度時，SMA培養(yǎng)基中H.lixii AH的LiP酶活最大，其活力為11.79U，比未添加上述試劑的10.556U提高了11.7%。

2.2.4 以MnP為指標(biāo)的正交試驗分析

以MnP為指標(biāo)的正交試驗分析如表9和10所示。由表10可發(fā)現(xiàn)，吐溫對H.lixii AH的MnP活性的影響最為顯著，藜蘆醇和Cu2+的影響一般。表9的直觀分析表明，A因素以第二水平、B因素以第二水平、C因素以第三水平最好。即當(dāng)藜蘆醇濃度為 3mmol/L，吐溫 60，Cu2+濃度為 0.08g/L 時，SMA培養(yǎng)基中H.lixii AH的MnP活性最大，為6.728U，比未添加試劑的4.875U提高了38.4%。

表9 以MnP為指標(biāo)的正交試驗直觀分析表

表10 以MnP為指標(biāo)的正交試驗方差分析表

2.2.5 以漆酶為指標(biāo)的正交試驗分析

以漆酶為指標(biāo)的正交試驗分析見表11和12。

表11 以漆酶為指標(biāo)的直觀分析表

表12 以漆酶為指標(biāo)的方差分析表

由表12可知，吐溫對H.lixii AH分泌的漆酶活性的影響最顯著，藜蘆醇和Cu2+濃度的影響一般。表11的直觀分析表明，藜蘆醇以第一水平、吐溫以第二水平、Cu2+以第二水平最好。即當(dāng)藜蘆醇濃度為 1mmol/L，吐溫 60，Cu2+濃度 0.5g/L時，SMA培養(yǎng)基中H.lixii AH的漆酶酶活性最大，為15.83U，但是比未添加上述試劑的21.25U有所降低。

3 結(jié)果與討論

利用正交試驗考察了Cu2+濃度、黎蘆醇濃度和吐溫在SMA培養(yǎng)基中對真菌H.lixii AH的上述各種酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同胞外酶受到以上條件影響情況有所差異。過氧化物酶和多酚氧化酶受Cu2+影響最大，優(yōu)選濃度均是0.2g/L。其中，過氧化物酶受到激活，多酚氧化酶稍受抑制。LiP、MnP和Lac受吐溫的影響較顯著，選用吐溫60。添加吐溫60后，LiP活性提高了11.7%，MnP活性提高了38%，然而Lac的酶活性略有下降。高濃度黎蘆醇促進LiP的分泌，而對其他胞外酶的活性有抑制作用。

［1］ Akin D E，Morrison W H，Rigsby L L，et al.Biological delignification of plant components by the white rot fungi ceriporiopsis subvermispora and cyathus stercoreus［J］.Ani malFeed Science and Technology，1996，63(1－4):305－321.

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Study on Characteristic of Enzyme Production of White－rot Fungus Hyprocrea Lixii AH

SHI Kai－ yi，2，XU Ning，TAO Xiu － xiang，2，HONG Fen － fen，2
(1.State Key Laboratory of Coal Conversion，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China;2.School of Chemical and Engineer，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China;3.School of Chemical and Life Sciences，Suzhou University，Suzhou 234000，China)

TQ426.97

A

1003－3467(2011)05－0029－041311

2011－03－01

國家自然科學(xué)基金資助(50374068);國家自然科學(xué)基金委員會創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金資助項目(50921002);中國礦業(yè)大學(xué)科技基金資助(E200407);宿州學(xué)院碩士科研啟動基金資助項目(2009YSS11)。

石開儀(1983－)，男，在讀博士，從事煤炭生物液化方面的研究，電話:15094356744;陶秀祥，教授，電話:(0516)83591057。