黃精低聚糖的分離純化及理化性質(zhì)研究

王彥志， 董晶晶， 劉富崗， 楊 云

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008)

黃精Polygonti Rhizoma是百合科黃精屬Polygonatum多種植物的根莖，《中國(guó)藥典》(2010版)收載了滇黃精Polygonatum kingianum Coll．et Hemsl、黃精 Polygonatum sibiricum Red．或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua．的干燥根莖入藥［1］，在民間同屬其它一些植物的根莖也被當(dāng)作黃精使用。作為一種傳統(tǒng)常用中藥，其性平，味甘，入脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤(rùn)燥等功效，臨床上多作為滋陰補(bǔ)益藥使用。所含化學(xué)成分豐富，有黃精多糖、皂苷、生物堿、醌類化合物、強(qiáng)心苷、木脂素、維生素和多種人體必需的氨基酸等化合物［2］。糖類是中藥中普遍存在的成分，可分為單糖、低聚糖、多糖及其衍生物。作為構(gòu)成生命體的最基本物質(zhì)之一，糖類在生命過(guò)程中起著極其重要的作用，它不僅是能量?jī)?chǔ)存和結(jié)構(gòu)物質(zhì)的存在形式，同時(shí)也作為生物信息的載體存在［3］。其中低聚糖因具有低熱量、高穩(wěn)定性、安全無(wú)毒等特點(diǎn)，近年來(lái)在保健、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［4］，關(guān)于低聚糖的研究和應(yīng)用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但是由于自身在組成、連接、衍生化、微觀不均一性等方面的高度復(fù)雜性及其檢測(cè)上的困難，致使其分離純化研究較少［5］。近年來(lái)關(guān)于黃精低聚糖的分析尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)其分離純化方法進(jìn)行探索性研究，以期為低聚糖的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 METTLER AE240電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);Revco ULT 1386-3-V39型超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司);Labconco Free Zone 6L真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司);UV-2201型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1．2 試藥 黃精藥材采集于河南省洛陽(yáng)市欒川龍峪灣，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院生藥教研室董誠(chéng)明教授鑒定為百合科黃精屬植物黃精Polygonatum sibiricum Red．的干燥根莖。將采挖的新鮮黃精除去蘆頭、須根及泥沙，清蒸1 h后干燥，粉碎，過(guò)20目篩，備用。D101大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司);活性炭粉末(天津市福晨化學(xué)試劑廠);硅藻土(天津市永大試劑化學(xué)開發(fā)中心);薄層層析硅膠G(青海海洋化工有限公司);Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司);茚三酮(上海市靈錦精細(xì)化工有限公司);咔唑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);葡萄糖(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);蔗糖(天津市福晨化學(xué)試劑廠);果糖(南京藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥廠);棉子糖(上?；瘜W(xué)試劑廠);水蘇糖(ACROSORGANICS，生產(chǎn)批號(hào):226085000);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 黃精中小分子糖的提取 稱取黃精藥材粉末500 g，加入12倍量80%乙醇，在85℃水浴條件下回流提取3 h，過(guò)濾，濾渣加10倍量的80%乙醇85℃水浴回流提取2 h，過(guò)濾，合并兩次濾液。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至少量，濃縮液倒至蒸發(fā)皿中40℃水浴揮盡乙醇，得黃精小分子糖部位浸膏。

2．2 黃精低聚糖的分離與純化［6］

2．2．1 D101大孔吸附樹脂柱 取市售D101大孔吸附樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，再依次用0．4 mol/L HCl、0．4 mol/L NaOH 浸泡后，抽濾，蒸餾水洗至中性，濕法裝柱，蒸餾水作流動(dòng)相平衡樹脂。稱取適量黃精小分子糖部位浸膏，用蒸餾水溶解后上樣，完畢以后，少量蒸餾水沖洗柱壁至無(wú)樣品黏附，保鮮膜封柱口，靜置過(guò)夜，使樹脂盡量將皂苷、黃酮等雜質(zhì)完全吸附。蒸餾水洗脫，體積流量1 mL/min，洗脫至 Molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)出現(xiàn)為止，合并水洗脫部位溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，備用。

2．2．2 活性炭柱層析 取活性炭粉末置于150℃烘箱中干燥2 h，用20%HCl煮沸30 min，趁熱抽濾，并用熱水洗滌至中性，110℃干燥后備用?；钚蕴颗c硅藻土按1∶1．5比例混合，用研缽攪拌均勻，干法裝于帶砂芯濾板的玻璃柱中，減壓抽實(shí)。將水洗脫部位濃縮液上活性炭柱，靜置過(guò)夜，使其充分吸附，蒸餾水洗脫至Molish反應(yīng)檢識(shí)呈陰性，試驗(yàn)中采用減壓裝置增加流量，每250 mL收集一份，合并水洗脫部位溶液并減壓濃縮。取活性炭水洗脫部位浸膏適量，用蒸餾水溶解后和單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以異丙醇-乙酸乙酯-水(7∶1∶2)進(jìn)行展開，取出，晾干后，噴苯胺-二苯胺-磷酸，置于85℃烘箱內(nèi)，顯色。由薄層色譜圖(圖1)可知，水洗脫部位溶液除了可能含有大量的葡萄糖、果糖、蔗糖等小分子糖外，在棉子糖(三糖)下方有斑點(diǎn)出現(xiàn)，推測(cè)可能為聚合度大于3的低聚糖。

圖1 活性炭水洗脫部位薄層色譜圖

2．2．3 Sephadex LH-20凝膠柱層析 取活性炭水洗脫部位浸膏約1 g，少量蒸餾水溶解后，用0．45μm微孔濾膜過(guò)濾，注射器吸取濾液沿柱壁繞圈上樣，完畢以后用少量蒸餾水沖洗注射器與柱壁至無(wú)樣品吸附，于室溫下用蒸餾水進(jìn)行洗脫，體積流量為0．5 mL/min，每管收集3 mL，共收集90份。

首先，采用薄層色譜法對(duì)洗脫樣品進(jìn)行檢識(shí)，取樣品溶液和單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以正丁醇-甲酸-水(4∶6∶1)進(jìn)行展開，取出，晾干后，噴苯胺-二苯胺-磷酸，置于85℃烘箱內(nèi)，顯色，結(jié)果如圖2。同時(shí)，采用紫外-可見分光光度法對(duì)洗脫組份進(jìn)行檢測(cè)。苯酚-硫酸法隔管測(cè)定其吸收度，即取洗脫液0．4 mL置于具塞試管中，加蒸餾水0．4 mL、5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻后室溫放置30 min，以蒸餾水作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸收度［7］。以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，如圖3。根據(jù)薄層色譜圖及洗脫曲線顯示將13～39合并作為黃精低聚糖樣品(RPO-1)，40～71合并作為小分子糖部位。將其減壓濃縮后－82℃真空冷凍干燥48 h，呈灰白色疏松粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 Sephadex LH-20凝膠柱層析流份薄層色譜圖

圖3 Sephadex LH-20凝膠柱層析洗脫曲線

2．3 RPO-1的理化性質(zhì)研究

2．3．1 RPO-1 為灰白色疏松粉末，微甜，無(wú)臭，易吸濕，水溶性好，極易溶于熱水，不溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷和苯等有機(jī)溶劑，熱穩(wěn)定性較好。

2．3．2 Molish反應(yīng) 取1 mg/mL樣品溶液1mL，加入5%α-萘酚乙醇液1～3滴，搖勻后沿試管壁緩緩加入濃硫酸約2 mL，切勿搖動(dòng)，觀察現(xiàn)象:兩液面交界處有紫色環(huán)產(chǎn)生，表明此樣品為糖類化合物。

2．3．3 FeCl3反應(yīng) 取1 mg/mL樣品溶液1滴，溶于1 mL乙醇中，加入1%FeCl3醇液1～2滴，以蒸餾水為陰性對(duì)照，以蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照，觀察現(xiàn)象:樣品溶液顏色無(wú)變化，呈陰性，表明樣品中不含酚類物質(zhì)。

2．3．4 淀粉試驗(yàn) 取樣品溶液少量，加入1滴碘酒，以淀粉溶液作對(duì)照。觀察現(xiàn)象:樣品溶液在加入碘酒后未變藍(lán)色，表明樣品中不含淀粉類物質(zhì)。

2．3．5 硫酸-咔唑反應(yīng) 取樣品3 mg左右，加水稀釋至200 μL，然后加咔唑-硫酸試劑1．5 mL，混勻，加塞，置于 100℃烘箱中保溫40～45 min，取出冷卻至室溫，以蒸餾水、棉子糖為陰性對(duì)照，以半乳糖醛酸為陽(yáng)性對(duì)照，觀察現(xiàn)象:樣品溶液為藍(lán)綠色，未顯示紫紅色，表明樣品中不含糖醛酸。

2．3．6 茚三酮試驗(yàn) 取1 mg/mL樣品溶液1 mL，加入2%茚三酮試劑1mL，加熱煮沸30 s，以蒸餾水為陰性對(duì)照，觀察現(xiàn)象:樣品溶液顏色無(wú)變化，表明樣品中不含有氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)。

2．3．7 雙縮脲試驗(yàn) 試劑 A:NaOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1 g/mL的水溶液;試劑B:CuSO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．01 g/mL的水溶液。取1 mg/mL樣品溶液1 mL，加入雙縮脲試劑A 2 mL(必須營(yíng)造堿性環(huán)境)，再加入雙縮脲試劑B 3～4滴，搖蕩均勻，靜置5 min，以蒸餾水為陰性對(duì)照，觀察現(xiàn)象:樣品溶液顏色無(wú)變化，呈陰性，表明樣品中不含多肽和蛋白質(zhì)。

2．4 RPO-1樣品總糖的測(cè)定

2．4．1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50．05mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為500．5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2．4．2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液 1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5 mL 于 25 mL 量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 20．02、30．03、40．04、50．05、60．06、70．07 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2．0 mL置于具塞試管中，加5%苯酚溶液1 mL，再加濃硫酸5 mL，搖勻后室溫放置40 min，以蒸餾水作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸收度。以吸收度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 y=0．015 6x+0．017 6(r=0．999 5)，葡萄糖質(zhì)量濃度在20．02～70．07μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，與吸收度呈良好的線性關(guān)系。

2．4．3 測(cè)定結(jié)果 精密稱取RPO-1樣品適量，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取溶液2．0 mL置于具塞試管中，加5%苯酚溶液1 mL，再加濃硫酸5 mL，搖勻后，室溫放置40min，以蒸餾水作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸收度，將其代入回歸方程計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 RPO-1樣品總糖測(cè)定結(jié)果

3 討論

3．1 本實(shí)驗(yàn)建立了簡(jiǎn)單方便的黃精低聚糖分離純化工藝，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)樣品中不含酚類物質(zhì)、淀粉、糖醛酸、大分子蛋白質(zhì)、多肽和核酸，為今后進(jìn)一步研究其單糖組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性等提供理論參考。

3．2 苯酚-硫酸比色法測(cè)定黃精低聚糖的原理［8］是低聚糖在濃硫酸的作用下，先水解為單糖，迅速脫水形成糠醛衍生物，然后與苯酚縮合為有色化合物，在490 nm處有特征吸收。本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定總糖時(shí)用80%乙醇處理樣品，消除了干擾成分，結(jié)果可靠;同時(shí)采用苯酚-硫酸法，簡(jiǎn)單快速、顯色穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好，生成的顏色持久［9］。通過(guò)此法測(cè)得其樣品總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91．3%，但是由于糖類物質(zhì)水解為單糖難易程度不同，故水解條件不同。水解不夠，單糖不能充分釋放出來(lái);水解條件過(guò)度，釋放的單糖或有關(guān)的糖醛衍生物部分可能會(huì)被破壞。因此要嚴(yán)格掌握好實(shí)驗(yàn)的操作條件［10］。

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