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    滋陰經(jīng)方經(jīng)TGF-β途徑抑制小鼠自發(fā)乳腺癌生長的機(jī)理

    2011-09-14 09:58:50鄭里翔林棟美劉紅寧余世平
    中成藥 2011年10期
    關(guān)鍵詞:六味地黃中醫(yī)藥乳腺癌

    鄭里翔, 林棟美, 劉紅寧, 余世平

    (江西中醫(yī)學(xué)院,江西南昌330004)

    乳腺癌是嚴(yán)重危害廣大婦女的健康最常見的惡性腫瘤之一。目前國內(nèi)外對乳腺癌的治療,仍以手術(shù)為主,化療、放療、激素和免疫等治療法,但這些療法常嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。而中醫(yī)藥在防治乳腺癌方面的優(yōu)勢日益突顯,如可減毒增效、增加患者的生存期和生存質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,乳腺癌發(fā)病機(jī)制是正虛邪實、虛實夾雜之癥,病變與肝腎脾及沖任有密切關(guān)系,其中正氣不足是乳腺癌發(fā)生的主要原因,肝郁脾虛、沖任失調(diào)是發(fā)生發(fā)展的重要因素,而邪氣入侵則是重要條件。中醫(yī)的臨床實踐已經(jīng)證明:乳腺癌患者,無論是在發(fā)病前、手術(shù)后以及放化療后均會出現(xiàn)陰虛,可見陰虛貫穿于乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的整個過程,這為中醫(yī)藥防治乳腺癌提供了重要的思路??梢娮剃幨欠乐稳橄侔┲匾氖侄?。六味地黃丸是滋陰名方,有大量的有關(guān)防治乳腺癌報道[1-5]。前期實驗也已證實:該方可抑制自發(fā)乳腺癌的生長,但目前該方的作用機(jī)理尚不清楚。一系列的實驗研究表明:TGF-β信號途徑在人類乳腺癌的發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性的作用,它的表達(dá)水平的高低與乳腺癌的輕重有直接的關(guān)系[6-7]。故本研究將從TGF-β/ERK信號途徑入手,研究六味地黃丸的作用機(jī)理。

    1 實驗材料

    1.1 試劑 六味地黃丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(批號:北京同仁堂,國藥準(zhǔn)字Z11021283,每粒0.2 g,每瓶裝360粒);Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,PCR引物由上海生工合成,兔抗 TGF-β、p-ERK1/2(ERK1p44,ERk2p42)單克隆抗體購于 SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC,辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗兔IgG單克隆抗體購于北京中杉金橋公司,其他化學(xué)試劑都是國產(chǎn)分析純試劑。

    1.2 儀器 ZT-12P生物組織自動脫水機(jī) ,YB-6D生物組織石蠟包埋機(jī),RM2235切片機(jī) LEICA,YT-6C生物組織攤烤片機(jī);OLYMPUS電子顯微鏡 (日出),PCR擴(kuò)增儀(美國)、BIO-RAD垂直電泳儀 (美國),凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha),高速冷凍離心機(jī)(日本),PCR儀(美國),核酸蛋白質(zhì)分析儀(Eppendorf)。

    1.3 實驗動物及分組 清潔級昆明小鼠360只,雌性種鼠,已產(chǎn)仔若干代,小鼠鼠齡約為11.5月,平均體質(zhì)量38~40 g,由江西中醫(yī)學(xué)院動物中心提供(合格證號ZDW-NO.2007-170)。購買后,在封閉環(huán)境中、自然光線下進(jìn)行飼養(yǎng),保持室內(nèi)溫度18~22℃,相對濕度50% ~60%,小鼠自由進(jìn)水。每3天觸診乳腺部位一次,發(fā)現(xiàn)腫塊[8],隨機(jī)分成六味地黃丸[分高劑量組4.6g/(kg·d)、低劑量組 2.3g/(kg·d)]和對照組,六味地黃丸水蜜丸,于無菌室內(nèi)將120粒藥丸放入消毒研缽,加100 mL消毒蒸餾水研磨后,裝入消毒容器內(nèi),配成終質(zhì)量濃度為0.24 g/mL,置于4℃冰箱備用。按成人劑量12 g/d換算成小鼠給藥劑量,患瘤小鼠給藥劑量為高劑量4.6 g/(kg·d),低劑量為2.3 g/(kg·d)。六味地黃丸組灌胃給藥,直至患瘤小鼠瀕死期(癥狀:小鼠極度消瘦,精神萎靡,飲食明顯減少,表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍,心跳減弱,呼吸微弱,或出現(xiàn)周期性呼吸),對照組(發(fā)瘤未給藥)、正常組(未發(fā)瘤小鼠)灌胃生理鹽水(對照組給生理鹽水平均時間為59d;低劑量組給藥時間為83d;高劑量給藥時間為80.7d),處死,記錄發(fā)瘤至瀕死期時間,剝離瘤塊,稱質(zhì)量。留取部分行病理組織切片確診(光鏡下可見癌細(xì)胞排列呈片狀、巢狀,少部分癌細(xì)胞排列呈腺管樣,癌細(xì)胞核漿比例增大,胞核可見核分裂像)。

    2 實驗方法

    2.1 乳腺癌組織病理分析 取新鮮的癌組織用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定,分別用85% 、95%酒精、無水酒精逐漸脫水,再用二甲苯透明,石蠟包埋,切片與貼片,HE染色,X400觀察并拍照。

    2.2 半定量的RT-PCR 按照TRIZOL試劑說明書提取總RNA,在20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增。TGF-β、p-ERK上下游引物為:p-ERK1/2:F:5 '-TGCACCGTGACCTCAAGCCTT-3 ',R:5 '-GGCCAGAGCCTGTTCAACTTCAAT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度491bp;TGF-β1 F:5 '-GCAATGGGCTTAGTGTTCTGGGT-3 ',R:5 '-TGCCTTCCTGTTGGCTGAGTT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度 295bp;β-actin F:5 '-CGTGCGTGACATTAAAGAC-3 ',R:5 '-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度 476bp。

    25μLPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)(擴(kuò)增條件為:p-ERK mRNA:95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán),72℃終延伸5 min;TGF-β1 mRNA:95℃ 5 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán),72 ℃終延伸5 min)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠溴化乙錠電泳分離,用凝膠圖形分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照,觀察結(jié)果并測定灰度值,以擴(kuò)增的目的條帶和同時擴(kuò)增的β-actin的灰度值比對各基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行衡量。

    2.3 蛋白印跡 用SDS-PAGE電泳,半干轉(zhuǎn)印100 mA 40 min,4℃冰箱封閉過夜,與特異性抗體結(jié)合:將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度(兔抗TGF-β1稀釋比例為1∶400,小鼠抗p-ERK稀釋比例為1∶400);室溫下孵育1~2 h后或4℃冰箱孵育過夜,隨后用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min。將二抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度(辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗兔IgG稀釋比例為1∶25 000,辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG稀釋比例為1∶25 000),取3 mL稀釋液與膜接觸,室溫下孵育1~2 h后或4℃冰箱孵育過夜,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行上述蛋白的半定量分析。

    2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件,進(jìn)行LSD檢驗,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示。

    3 結(jié)果

    3.1 病理分析確診乳腺癌 經(jīng)HE染色后,正常小鼠乳腺細(xì)胞形態(tài)完整,腺管豐富(圖1A);對照組細(xì)胞數(shù)量較多,呈松散、紊亂樣排列,以散在和(或)小細(xì)胞群為主,腺管消失,細(xì)胞核大深染,核多形,層次增多,細(xì)胞異型性大,細(xì)胞排列雜亂無極性核,大小差異明顯(見圖1B),為典型的乳腺癌。

    圖1 不同組乳腺病理形態(tài)(10×40)

    3.2 六味地黃丸對腫瘤瘤質(zhì)量的影響 經(jīng)六味地黃丸治療后,瘤質(zhì)量明顯下降(P<0.01),說明六味地黃丸能明顯抑制腫瘤的生長(見圖2)。

    3.3 六味地黃丸對瘤體內(nèi)TGF-β、p-ERK基因表達(dá)產(chǎn)物的影響 實驗結(jié)果表明:六味地黃丸能明顯抑制瘤體中的TGF-β、p-ERK 基因的表達(dá)(P <0.01或 P <0.05)。見表2。

    圖2 六味地黃丸對荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響與對照組比較*P<0.05

    表2 六味地黃丸對瘤體內(nèi)TGF-β、p-ERK基因表達(dá)的影響 ( ± s)

    表2 六味地黃丸對瘤體內(nèi)TGF-β、p-ERK基因表達(dá)的影響 ( ± s)

    注:與對照組比較,*P <0.01。

    組別 劑量/(g/kg) mRNA 的表達(dá)量TGF-βp-ERK蛋白表達(dá)量TGF-βp-ERK正常組 0.66 ±0.14(15) 0.50 ±0.13(15) 0.47 ±0.08(14) 1.23 ±0.12(16)對照組 - 1.32 ±0.15(16) 1.14 ±0.14(16) 1.16 ±0.10(16) 3.83 ±0.16(16)六味地黃高劑量組 2.3 0.90 ±0.13*(15) 0.79 ±0.16*(15) 0.74 ±0.06*(15) 2.72 ±0.19*(15)六味地黃低劑量組 4.6 0.77 ±0.09*(16) 0.59 ±0.11*(16) 0.56 ±0.07*(16) 1.37 ±0.11*(16)

    4 討論

    目前中醫(yī)藥治療乳腺癌的方法主要有大補(bǔ)氣血、健脾和胃、滋陰補(bǔ)腎、活血養(yǎng)血、清熱解毒。黎壯偉等[10]根據(jù)晚期乳腺癌的病理特點及疾病發(fā)展的不同時期,將乳腺癌分為5型,對于其中肝腎虧虛型者,擬滋補(bǔ)肝腎、調(diào)和沖任,方用六味地黃丸加味;周斌等[11]認(rèn)為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的病因主要是腎虛,加之氣血兩虛,使其易被癌瘤所侵襲而發(fā)病,因此防治乳腺癌常采用以溫補(bǔ)腎陽、滋補(bǔ)腎陰、平衡陰陽、調(diào)理氣血法為主,臨床實踐已證實:六味地黃丸能改善乳腺癌患者的臨床癥狀,提高患者的生存質(zhì)量和延長患者的生存期[3-4]。

    圖2的結(jié)果表明:六味地黃丸能明顯抑制乳腺癌的生長(P<0.05),這是因為方中的熟地黃、山藥、山茱萸均能提高機(jī)體免疫機(jī)能、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生、抗氧化、抑制腫瘤生長;牡丹皮有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞作用;茯苓具有抗炎的功能[5],諸藥合用達(dá)到抑制腫瘤生長目的。

    同時六味地黃丸能明顯抑制腫瘤組織內(nèi)的TGF-β/p-ERK的基因表達(dá)(P<0.01或P<0.05)。研究表明:從果蠅到人類均有TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,TGF-β激活受體,進(jìn)一步激活ERK。ERK屬于酪氨酸蛋白激酶,是MAPK家族主要的和經(jīng)典的成員,主要傳遞細(xì)胞絲裂原信號,促進(jìn)細(xì)胞增殖。p-ERK是其活化形式。激活的ERK可促進(jìn)細(xì)胞漿靶蛋白磷酸化或調(diào)節(jié)其它蛋白激酶的活性。更重要的是激活的ERK進(jìn)入核內(nèi),促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性,它們所參與的信號傳導(dǎo)通路的過度活化與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[6-7]。故六味地黃丸抑制TGF-β/p-ERK基因的表達(dá),從而抑制了乳腺癌進(jìn)一步的發(fā)展。

    由于動物自發(fā)性腫瘤從其發(fā)生發(fā)展來看與人類腫瘤更相似,因而更適用于研究人類腫瘤。該模型最大的特點是實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處理,生存到一定年齡便自然發(fā)生乳腺腫瘤,排除了很多人為的干擾因素,使得影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的因素更有可能被發(fā)現(xiàn),因而更具有研究價值和前景[9]。

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