苦參堿大鼠腸吸收動(dòng)力學(xué)研究

馬小花， 魏玉輝， 王 丹， 武新安*

(1．蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州730000;2．蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000)

苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait．的干燥根，其性寒，味苦，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿之功效，其主要有效成分為苦參堿。目前，提純后的苦參堿單體已經(jīng)在臨床上廣泛用于抗癌、消炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗心律不齊、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、保肝和抗肝纖維化等［1-2］。

探討苦參堿腸道吸收狀況，對(duì)于確定臨床合理給藥方案及指導(dǎo)各種制劑的處方設(shè)計(jì)，具有重要意義。目前，預(yù)測(cè)藥物小腸吸收的方法有體外法、離體法、在體法和體內(nèi)法等［3］。在體法因不損傷研究部位的淋巴和循環(huán)系統(tǒng)而明顯優(yōu)于前兩種方法。其中大鼠單向腸灌流法(in situ rats single pass perfusion model，SPIP)能很好地模擬人體的內(nèi)環(huán)境，以接近生理?xiàng)l件的體積流量(0．2～0．35 mL/min)對(duì)一定腸段進(jìn)行單向灌流，從而根據(jù)進(jìn)出口藥物濃度差可方便求得藥物在該腸段的透過性，且結(jié)果與人體的試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性良好，因此在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用［4-5］。

關(guān)于苦參堿在大鼠的腸吸收，已有一些文獻(xiàn)報(bào)道。劉曉紅［1］采用大鼠外翻腸囊和Caco-2細(xì)胞這兩種腸吸收模型對(duì)氧化苦參堿和苦參堿的腸吸收特征及吸收動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究;何盛江等［6］用翻轉(zhuǎn)腸囊法研究了苦參堿在小腸的吸收特征，以及不同吸收促進(jìn)劑對(duì)苦參堿小腸吸收的影響?？紤]到大鼠在體單向腸灌流法由于在實(shí)驗(yàn)過程中不損傷血管和淋巴，藥物透過小腸上皮細(xì)胞后即被血液轉(zhuǎn)運(yùn)，能更真實(shí)的反應(yīng)藥物在腸道的吸收情況，而且在腸道中存在大量的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)藥物的吸收、分布等具有重要的調(diào)控作用［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體單向腸灌流模型，以重量法校正凈水流量，考察了不同腸段、藥物濃度、P-gp抑制劑和OCTs抑制劑對(duì)苦參堿腸吸收的影響，以揭示苦參堿的腸道吸收機(jī)制，便于使苦參堿能更好的為臨床充分發(fā)揮藥物療效提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1 實(shí)驗(yàn)儀器 島津LC-20AT二元梯度泵，SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，DGU-20A在線脫氣系統(tǒng)，CTO-20A柱溫箱，LC solution色譜工作站(島津，日本)，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)，XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，高速離心機(jī)(深圳國(guó)華儀器廠)，電子天平(北京賽多利斯，LT-224S)，蠕動(dòng)泵(上海之信儀器有限公司，DDB-600)，電熱恒溫水浴鍋(北京科偉，DXKW-4)。

1．2 試劑與試藥 苦參堿(寧夏紫荊花制藥有限公司，批號(hào) 030316，純度 ＞98．0%，Kerbs-Ringer＇s 緩沖液(自配，每1 L 含NaCl7．8 g，KCl0．35 g，CaCl20．37 g，NaHCO31．37 g，NaH2PO40．32 g，MgCl220 mg，葡萄糖1．4 g)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，去離子水(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制)。西咪替丁注射液(武漢安成醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào):H20050711)、維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào):H31021343)

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 Wistar大鼠16只，體質(zhì)量(260±30)g，購(gòu)于甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(甘)2004-0006．

2 方法與結(jié)果

2．1 灌流液中苦參堿的測(cè)定

2．1．1 色譜條件 色譜柱:依利特 Hypersil ODS2(4．6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為水相(0．05 mol/L磷酸二氫鈉∶0．1%三乙胺)-甲醇(75∶25);檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm，體積流量:1．0 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20μL。在該色譜條件下，苦參堿的出峰時(shí)間在7．5 min，灌腸液及維拉帕米和西咪替丁對(duì)其測(cè)定無干擾，苦參堿色譜圖見圖1。

圖1 苦參堿HPLC色譜圖Fig．1 HPLC chromatogram s ofmatrine

2．1．2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于10 mL量瓶中，用空白K-R腸灌流液溶解稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的貯備液，4℃貯藏備用。

精密吸取上述苦參堿貯備液適量，用空白K-R腸灌流液精密配置成質(zhì)量濃度為 3．91、7．81、15．63、31．25、62．50、125、250 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，按上述色譜條件測(cè)定。用峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=27 663C－3 825．2，r=0．999 9

2．1．3 苦參堿在腸灌流液中的穩(wěn)定性 取K-R緩沖液進(jìn)行大鼠在體小腸循環(huán)2 h得空白腸循環(huán)液，以此空白腸循環(huán)液配制高、中、低(250、31．25、3．91 μg/mL)濃度的苦參堿溶液，置37℃水浴中，分別于0、0．5、1．0、1．5、2．0 h 取樣 100 μL，以 10 000 r/min離心5 min后，吸取20μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，苦參堿在腸循環(huán)液中孵化2 h，其峰面積RSD為0．58%，說明2 h內(nèi)苦參堿在循環(huán)液中能夠保持相對(duì)穩(wěn)定。

2．1．4 精密度與準(zhǔn)確度 配制高、中、低(250、31．25、3．91 μg/mL)濃度的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)液，于同一天內(nèi)不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度;于不同天內(nèi)每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果測(cè)得高、中、低濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于2%;高、中、低濃度的準(zhǔn)確度在98% ～102%之間。

2．2 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)

2．2．1 實(shí)驗(yàn)方法［8-9］實(shí)驗(yàn)前將大鼠禁食16 h(自由飲水)，腹腔注射10%烏拉坦(1．0 g/kg)麻醉，固定并維持37℃體溫。沿腹中線打開腹腔，小心分離出待考察腸段，十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，各取約10 cm于兩端切口插入合適的硅膠管后結(jié)扎，并用沾有生理鹽水的紗布包裹腹部防止脫水。同時(shí)用預(yù)熱至37℃生理鹽水將腸內(nèi)容物輕輕沖洗干凈后用空氣將生理鹽水排凈。將硅膠管連接恒流裝置，換苦參堿灌流液小瓶以體積流量0．2 mL/min灌流，平衡15 min后認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此時(shí)迅速換準(zhǔn)確稱質(zhì)量的苦參堿灌流液(20 mL)繼續(xù)灌流，以準(zhǔn)確稱質(zhì)量的具塞小瓶每15 min接取流出液，實(shí)驗(yàn)共收集灌流液7次，灌流完成后剪下被考察的腸段，量取小腸的內(nèi)徑和長(zhǎng)度，并將灌流液小瓶和收集液小瓶稱重，以計(jì)算流入腸道的液體量，收集液以10 000 r/min離心5 min后用HPLC測(cè)定收集液中苦參堿的濃度。

2．2．2 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)采用重量分析法對(duì)灌流液的流入和流出的體積進(jìn)行校正，消除其體積變化的影響，按下列方程式計(jì)算吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀吸收系數(shù)(Papp)。

式中:Vin和Vout分別為腸道進(jìn)、出口灌流液的體積(mL);Cin和Cout分別為腸道進(jìn)、出口灌流液的濃度(μg/mL);Q為灌流速度(mL/min);l和r分別為被灌流腸段的長(zhǎng)度和內(nèi)徑(cm)。

2 h藥物吸收量(M)，M=X1－X2。X1為灌流前腸循環(huán)液中含藥量，X2為灌流結(jié)束時(shí)腸循環(huán)液中含藥量。

2．2．3 苦參堿在大鼠不同腸段吸收情況 精密配制含400μg/mL的苦參堿灌流液，按照實(shí)驗(yàn)方法分別進(jìn)行十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸灌流，測(cè)定灌流液中苦參堿，并計(jì)算吸收參數(shù)，其吸收參數(shù)見表1。經(jīng)過方差分析，大鼠各腸段之間有差異。由表1可見，不同腸段的吸收速率常數(shù)依次下降，即空腸＞回腸＞結(jié)腸＞十二指腸。十二指腸與結(jié)腸的吸收速率常數(shù)比較無顯著性差異(P＞0．05)，空腸段與十二指腸的吸收速率常數(shù)相比，具有明顯差異(P＜0．01)，與結(jié)腸相比有差異(P＜0．05)。而且據(jù)文獻(xiàn)［10］報(bào)道大鼠 Papp＜0．03×10－4cm/s和 Papp＞0．2×10－4cm/s時(shí)分別表示藥物難以吸收和易于吸收，由表1可知，各個(gè)腸段的Papp值均大于0．2×10－4cm/s，說明苦參堿在各個(gè)腸段均有吸收，在空腸段的吸收尤為明顯。

表1 不同腸段苦參堿的吸收參數(shù)比較(n=5， ± s)Tab．1 Absorption parameters of matrine in different segment of rat intestine with SPIPmodel(n=5， ± s)

表1 不同腸段苦參堿的吸收參數(shù)比較(n=5， ± s)Tab．1 Absorption parameters of matrine in different segment of rat intestine with SPIPmodel(n=5， ± s)

與十二指腸組比較，＊＊P ＜0．05;與結(jié)腸組比較，*P ＜0．05。＊＊P ＜0．01 vs duodenum;*P ＜0．05 vs colon．

腸段 Ka×10－2/min Papp×10－3/(cm/min)十二指腸 0．25±0．06＊＊ 0．25±0．06＊＊空腸 0．80 ±0．02 0．90 ±0．04回腸 0．40 ±0．14 0．36 ±0．10結(jié)腸 0．35 ±0．10* 0．28 ±0．04*

2．2．4 濃度對(duì)苦參堿腸吸收的影響 精密配制含100、200、400 μg/mL 的苦參堿灌流液，根據(jù) 2．2．3項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選大鼠空腸段結(jié)扎，按濃度依次進(jìn)行灌流，藥物的吸收量和吸收速率常數(shù)Ka見表2和圖2。由表2可見，在不同濃度條件下苦參堿的吸收量隨藥物濃度的增大而增大，表觀吸收速率常數(shù)Ka無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。由圖2可知在100～400 μg/mL內(nèi)藥物的吸收量與濃度呈線性關(guān)系，說明苦參堿的濃度對(duì)小腸的吸收沒有影響，因此推測(cè)苦參堿在大鼠空腸中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)可能是一種被動(dòng)擴(kuò)散過程。

2．2．5 P-gp或OCTs對(duì)苦參堿吸收的影響 精密配制含400μg/mL的苦參堿灌流液(內(nèi)含P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米100μg/mL或內(nèi)含OCTs抑制劑西咪替丁400 μg/mL)，根據(jù)2．2．1項(xiàng)試驗(yàn)方法，選取空腸段分別進(jìn)行灌流，考察苦參堿在空腸的吸收是否受到P-gp和OCTs外排作用的影響，結(jié)果見表3。兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被抑制后苦參堿在空腸段的吸收參數(shù)與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明苦參堿的吸收不受P-gp和OCTs的影響，初步說明苦參堿可能不是P-gp或OCTs的底物。

表2 不同質(zhì)量濃度對(duì)苦參堿腸吸收參數(shù)的影響(n=5， ± s)Tab．2 Effect of the concentrations ofmatrine perfusion on their absorption parameters using SPIP model(n=5， ± s)

表2 不同質(zhì)量濃度對(duì)苦參堿腸吸收參數(shù)的影響(n=5， ± s)Tab．2 Effect of the concentrations ofmatrine perfusion on their absorption parameters using SPIP model(n=5， ± s)

質(zhì)量濃度/(μg/mL) Ka×10－2/min M/(μg/h)100 0．79 ±0．11 508．79 ±190．63 200 0．81 ±0．09 1 491．22 ±50．16 400 0．80 ±0．02 2 647．82 ±42．40

圖2 3種質(zhì)量濃度對(duì)苦參堿吸收量的影響Fig．2 Effect of three concentrations of matrine perfusion on their absorption

表3 P-gp或OCTs抑制劑對(duì)苦參堿吸收參數(shù)的影響(n=5， ± s)Tab．3 Effect of P-gp and OCTs inhibitor on the absorption ofmatrine(n=5， ± s)

表3 P-gp或OCTs抑制劑對(duì)苦參堿吸收參數(shù)的影響(n=5， ± s)Tab．3 Effect of P-gp and OCTs inhibitor on the absorption ofmatrine(n=5， ± s)

Ka×10－2/min Papp×10－3/(cm/min)苦參堿0．80 ±0．02 0．90 ±0．04苦參堿 +維拉帕米 0．82 ±0．12 0．86 ±0．15苦參堿+西咪替丁0．75 ±0．21 0．80 ±0．26

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際上常用的大鼠在體單向腸灌流模型研究苦參堿的腸吸收，此方法灌流速度接近小腸正常的蠕動(dòng)速度，與口服給藥后藥物接觸的腸道環(huán)境更接近，因此大鼠腸灌流所得的結(jié)果可能與人體有較好的相關(guān)性，而且用重量法校正凈水流量，方法簡(jiǎn)便可行，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，并且與用酚紅校正的腸灌流法相比，減小了由于酚紅等標(biāo)識(shí)物吸收而造成的誤差。

本試驗(yàn)結(jié)果大鼠四個(gè)腸段的Papp值均大于0．2×10－4(cm/s)表明苦參堿在小腸吸收較好，以空腸段的吸收尤為顯著，可考慮將其制成口服的靶向制劑。不同腸段的吸收速率常數(shù)按空腸、回腸、結(jié)腸、十二指腸依次下降，可能是由于空腸和結(jié)腸腸腔內(nèi)藥物的有效吸收表面積比空腸吸收藥物的有效表面積小，而且十二指腸的pH值為5～6，苦參堿作為有機(jī)弱堿性藥物，當(dāng)pH降低時(shí)，苦參堿呈解離狀態(tài)，不利于吸收。劉曉紅［1］用離體的外翻腸囊法和Caco-2細(xì)胞對(duì)苦參堿的腸吸收研究顯示苦參堿的腸吸收主要為經(jīng)細(xì)胞通路被動(dòng)擴(kuò)散吸收，且不受P-糖蛋白外排蛋白的影響，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;而何盛江等［6］用翻轉(zhuǎn)腸囊法研究苦參堿在空腸、十二指腸、回腸吸收速率沒有顯著性差異(P＞0．05)，可能與本實(shí)驗(yàn)采用的方法不同有關(guān)。

P-糖蛋白和有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是兩種重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)大部分藥物的生物利用度和組織分布有重要的調(diào)控作用。P-gp在空腸、遠(yuǎn)端回腸、結(jié)腸表達(dá)依次增加。作為P-gp的底物通常需要既具有脂溶性又具有水溶性，同時(shí)在生理pH下化合物呈陽(yáng)離子，如已知的底物維拉帕米、喹啉類、吲哚類生物堿等均為陽(yáng)離子化合物。OCTs在肝臟、腎臟和腸道中均有表達(dá)，考慮到OCTs的底物包括許多陽(yáng)離子化合物，如四乙胺、硫胺、1-甲基-4-苯基吡啶等，而苦參堿屬于喹諾里西丁類生物堿，與OCTs的底物結(jié)構(gòu)相似。為此，本實(shí)驗(yàn)考察了P-gp和OCTs對(duì)苦參堿的吸收是否有影響。結(jié)果表明，在灌腸液中分別加入維拉帕米和西咪替丁這兩種抑制劑后，所得的Ka和Papp值與苦參堿直接灌流相比無明顯差異。因此，苦參堿可能不是P-gp和OCTs的底物，P-gp和OCTs可能不參與苦參堿在腸道的吸收。比如在臨床用藥中苦參堿聯(lián)合順鉑化療時(shí)［11］，順鉑是P-gp的底物［12］，順鉑與苦參堿可能不會(huì)出現(xiàn)影響藥物臨床療效的P-gp分子水平上的競(jìng)爭(zhēng)性藥物相互作用，從而提高了藥物應(yīng)用的安全性和有效性。

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