土鱉蟲超微粉體中游離氨基酸的測定及指紋圖譜研究

蔡 萍， 萬 丹， 肖 娟， 張水寒， 蔡光先

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建重點實驗室，湖南省教育廳中藥粉體技術(shù)創(chuàng)新團隊，湖南長沙410013)

土鱉蟲，又稱地鱉蟲，在我國具有悠久的藥用歷史。其雌蟲體具有散血瘀、消堅結(jié)、解凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經(jīng)等功效。在我國，常用于入藥的土鱉蟲有地鱉 Eupolyphaga sinensis Walker、冀地鱉 Steleophaga plancyi(Boleny)和金邊土鱉Opishoplatia orientalis Burmeister［1］。土鱉蟲中含有豐富的氨基酸［2-4］。目前，用柱前衍生化法分析土鱉蟲氨基酸的報道還未見，本實驗采用PITC柱前衍生化高效液相色譜法檢測土鱉蟲中的游離氨基酸，為評價土鱉蟲超微粉體內(nèi)在質(zhì)量提供一定的參考依據(jù)。

1 實驗儀器、試藥與藥材

1．1 儀器 島津LC-10ATVP高效液相色譜儀，配置SPD-M10AVP型二極管陣列檢測器、CTO-10ASVP柱溫箱，CLASS-VP島津工作站;KQ3200型超聲波清洗器(220V，40KHz);BFM-T6BI“貝利”微粉機(濟南貝利粉碎技術(shù)工程有限公司);旋渦混合器:金壇市大地自動化儀器廠;T-214型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1．2 試劑 甲醇、乙腈(色譜純，Tedia公司生產(chǎn))，冰醋酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，異硫氰酸苯酯(PITC)(上海金山亭新化工試劑廠)，無水乙酸鈉、三乙胺、正己烷均為恒興試劑，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

1．3 對照品 天冬氨酸 Asp，谷氨酸 Glu，絲氨酸Ser，甘氨酸 Gly，組氨酸 His，精氨酸 Arg ，丙氨酸Ala，脯氨酸 Pro，纈氨酸 Val，酪氨酸 Tyr，異亮氨酸Ile，亮氨酸 Leu，色氨酸 Trp，苯丙氨酸 Phe，賴氨酸Ly，上述氨基酸對照品均購于Sigma公司。

1．4 藥材 10批土鱉蟲藥材分別購自四川、廣西、湖南、陜西、江西、安徽等地(見表1)，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院生藥鑒定室鑒定為地鱉、冀地鱉及金邊土鱉蟲雌體，加工成超微粉體。土鱉蟲對照藥材(批號:121489-200602)。土鱉蟲經(jīng)貝利粉碎機超微粉碎后，粒徑檢測采用Winner 3001干粉激光粒徑儀，結(jié)果D50均值為12．285μm，小于75μm的顆粒累積在95%以上。

表1 10批土鱉蟲的來源Tab．1 Ten batches of Eupolyphaga from different sources

2 實驗方法與結(jié)果

2．1 色譜條件［5-7］色譜柱為依利特 Hypersil C18BDS柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相 A 乙腈-水(4∶1)，B 醋酸鈉緩沖溶液(pH=6．5)-乙腈(97∶3)，檢測波長為254 nm，體積流量為 1 mL/min，柱溫為30℃。按表2進行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫程序Tab．2 The gradient elution

2．2 供試品溶液的制備及衍生化 稱取樣品及對照藥材各0．4 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入25 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，補足減失的質(zhì)量，離心，取上層液2 mL，置于10 mL離心管內(nèi)，加入 0．1 mol/L異硫氰酸苯酯(PITC)-乙腈溶液(12 ∶988)1 mL，1．0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液(139∶861)1 mL，漩渦混合1 min，暗處放置1 h，再加入正己烷4 mL，漩渦混合1 min，靜置10 min，吸取下層溶液過0．45μm微孔濾膜過濾，備用。

2．3 對照品溶液的制備及衍生化 分別稱取各氨基酸對照品適量，用50%甲醇溶解配制成混合對照品溶液，吸取對照品溶液2 mL，照上法進行衍生化處理，即得。

2．4 空白溶液的制備及衍生化 取50%甲醇溶液2 mL，照上法進行衍生化處理，即得。

2．5 方法學(xué)考察

2．5．1 指紋圖譜的建立 分別精密吸取混合對照品溶液、空白溶液、對照藥材溶液、供試品溶液各5 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄52 min的色譜圖，見圖1。

2．5．2 精密度試驗 精密吸取2．3項下的混合對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣5次，其相似度大于0．99，符合指紋圖譜的要求。

2．5．3 穩(wěn)定性試驗 取2．2項下的同一份供試品溶液(NO．1 海川)，分別在制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣5μL，結(jié)果顯示，其相似度大于0．98，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的檢測要求。

2．5．4 重復(fù)性試驗 取同一批土鱉蟲超微粉體樣品(NO．1海川)5份，分別按2．2項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進樣5μL，結(jié)果顯示，其相似度大于0．97。表明此方法的重復(fù)性良好。

2．6 指紋圖譜的建立

圖1 土鱉蟲游離氨基酸HPLC圖譜Fig．1 HPLC chromatogram of free am ino acids in Eupolyphaga

2．6．1 共有指紋峰的標(biāo)定 按《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》規(guī)定［8］，采用相對保留時間標(biāo)定共有指紋峰，以圖譜中11號峰(脯氨酸)作為參照峰，計算各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的比值，共有色譜峰24個，共有峰峰面積占總峰面積均在80%以上，各峰相對保留時間的 RSD% 分別為 0．49%、0．63%、0．39%、0．43%、0．32%、0．29%、0．22%、0．13%、0．13%、0．08%、0．00%、0．03%、0．18%、0．24%、0．25%、0．25%、0．30%、0．35%、0．52%、0．85%、0．43%、0．38%、0．45%、0．32%。

2．6．2 指紋圖譜的相似度計算 采用中國藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價》軟件(2．0版)對10批不同產(chǎn)地土鱉蟲超微粉體進行相似度評價。設(shè)置第一批樣品圖譜為參照物圖譜，時間窗0．5，中位數(shù)法，多點校正后自動匹配，生成對照指紋圖譜(見圖2)，10批樣品的相似度達到0．95以上，相似度計算結(jié)果見表3。

圖2 10批土鱉蟲超微粉體的HPLC圖譜Fig．2 HPLC fingerprint of 10 batches of samples

表3 10批土鱉蟲超微粉體指紋圖譜相似度結(jié)果Tab．3 The sim ilarity evaluation of Eupolyphaga for 10 batches of samples

2．7 氨基酸測定 土鱉蟲超微粉體線性關(guān)系考察、加樣回收試驗及定量測定 分別取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、賴氨酸對照品，配制成質(zhì)量濃度分別為 0．012 6、0．068 0、0．019 5、0．072 0、0．015 2、0．015 6 mg/mL 的對照品溶液，按2．3 項進行處理，按上述色譜條件進樣，以氨基酸對照品峰面積為縱坐標(biāo)，進樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。見表4。精密稱取已知氨基酸量的土鱉蟲超微粉體6份，分別加入適量的甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、賴氨酸，按2．2項下方法制備供試品溶液，計算回收率。結(jié)果，甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、賴氨酸的平均回收率分別為 90．26% 、92．53% 、91．22%、96．20%、95．57% 和 98．27%。RSD% 分別 2．1%、1．8%、2．5%、2．4%、3．2%、1．2%。根據(jù)線性回歸方程，計算10批土鱉蟲超微粉體中6種氨基酸。見表5。

表4 6種氨基酸線性關(guān)系Tab．4 Linear relationship of six kinds of free am ino acids

表5 10批土鱉蟲超微粉體的6種氨基酸測定結(jié)果Tab．5 Content of six kinds of free am ino acids in 10 batches of samples

3 討論

3．1 測定方法的選擇 柱前衍生化高效液相色譜法分析氨基酸分析時間較短、方法靈活多樣、靈敏度高，據(jù)報道目前主要的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、異硫氰酸苯酯 (PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC)等［9-11］。其中用PITC柱前衍生采用常規(guī)C18柱、UV檢測器就可以檢測，且產(chǎn)物穩(wěn)定。所以本實驗采用此試劑進行柱前衍生化進行氨基酸的檢測。

3．2 提取方法的考察 分別用回流及超聲的提取方法對樣品進行處理，但回流后的樣品與衍生化試劑反應(yīng)后有白色渾濁物生成，影響實驗結(jié)果，所以本實驗采用超聲的提取方法;提取溶劑分別考察水、50%甲醇、甲醇，考慮到氨基酸易長菌降解［12］，且用50%甲醇提取液衍生化后，分離效果好，出峰數(shù)多，故采用50%甲醇溶液作為提取溶液。

3．3 進樣量的選擇 試驗中曾嘗試進樣量10μL、8μL，但對照品溶液及供試品溶液中天冬氨酸和谷氨酸峰都會分叉，其他峰均正常，當(dāng)進樣量改為5 μL時，未出現(xiàn)這種情況，可能是因為色譜柱超載［13］。

3．4 記錄時間的選擇 按上述色譜條件進樣，參照混合對照圖譜及空白圖譜，可知在52 min后均為衍生化試劑峰，且峰形雜亂，故確定記錄時間為52 min。

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