大鼠白念珠菌支氣管肺感染時(shí)肺組織Toll樣受體2的表達(dá)及意義

林莉 王莉 周洋洋 陳耀華 孟新麗 康健

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院呼吸內(nèi)科呼吸疾病研究所，沈陽 110001)

支氣管肺念珠菌感染常發(fā)生在免疫功能低下的患者，近年來，隨著免疫功能低下的患者的增多，支氣管肺念珠菌感染的患病率和死亡率也不斷升高。念珠菌感染的發(fā)生及加重與機(jī)體的免疫功能有著密切關(guān)系，作為天然免疫受體中的Toll樣受體2(Toll like receptor2，TLR2)在白念珠菌感染中的作用受到關(guān)注。有研究顯示TLR2基因缺陷鼠具有抵御播散性白念珠菌感染的發(fā)生［1］。也有研究認(rèn)為TLR2的表達(dá)，能夠激活針對(duì)白念珠菌感染的免疫反應(yīng)，對(duì)抗感染［2］。TLR2在支氣管肺念珠菌感染的發(fā)生中可能起到較重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)此，本研究通過建立白念珠菌支氣管肺感染大鼠模型，觀察白念珠菌支氣管肺感染后肺組織中TLR2水平的表達(dá)及變化，探討TLR2在白念珠菌支氣管肺感染發(fā)生和發(fā)展中可能的作用，為研究念珠菌肺部感染的發(fā)病機(jī)制及防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

6周齡SD大鼠36只，雌雄不拘，體重 (250±50)g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌菌株(編號(hào)070908853)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室提供。TLR2抗體試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組 (指免疫功能正常，用生理鹽水進(jìn)行支氣管肺灌注)、免疫低下組(指免疫功能受抑制后，用生理鹽水進(jìn)行支氣管肺灌注)和感染組 (指免疫功能受抑制后，用白色念珠菌懸液進(jìn)行支氣管肺灌注)，每組各12只。

白念珠菌混懸液的制備［3］取標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌菌株，使用沙堡培養(yǎng)基在28℃真菌培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)一代，使用濁度法將白念珠菌混合配制成混懸液，使用濁度計(jì)調(diào)整菌量約為 (1～5)×108CFU/mL。

免疫功能低下動(dòng)物模型建立 參照文獻(xiàn)描述的方法［4-5］用醋酸氫化可的松80 mg/kg，隔日1次，共7次給與大鼠皮下注射，成功制成免疫低下模型;正常組于相同時(shí)間給予同等劑量的生理鹽水皮下注射。

感染動(dòng)物模型建立 參照文獻(xiàn)描述方法［5］。成功建立動(dòng)物免疫功能低下模型后的第2天開始，用4%水合氯醛 (0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉動(dòng)物，麻醉成功后，感染組經(jīng)氣管插管注射白色念珠菌混懸液0.2 mL，正常組及免疫低下組經(jīng)氣管插管注射同等劑量的生理鹽水。每天觀察大鼠的運(yùn)動(dòng)、進(jìn)食、飲水、毛發(fā)、呼吸、精神狀態(tài)等。感染組表現(xiàn)為倦怠、萎靡、不嗜食水、毛發(fā)蓬亂、呼吸急促。

分離肺組織 接種后第3天和第7天分別隨機(jī)選取各組6只大鼠，解剖胸腔，摘取肺組織，約取0.5 cm ×0.5 cm ×0.4 cm 右肺下葉置于 4%多聚甲醛固定液中，脫水，固定，制成切片，待免疫組織化學(xué)染色。

觀察指標(biāo) ①肺組織肉眼和顯微鏡下變化:分離肺組織后，首先肉眼觀察各葉肺組織的大體變化。取右下葉肺組織，生理鹽水沖洗5次，經(jīng)固定、脫水、透明、浸臘、包埋、切片等過程制成石蠟切片，行常規(guī)HE染色及PAS染色，顯微鏡下觀察肺組織炎癥反應(yīng)。②免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織TLR2的表達(dá):應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺組織TLR2蛋白表達(dá)，Image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定肺組織TLR-2陽性細(xì)胞的積分光密度 (integral optical density，IOD)值，以IOD值反映肺組織切片中相應(yīng)陽性物質(zhì)的表達(dá)程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料均以(±s)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，組間的比較應(yīng)用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理學(xué)結(jié)果

大體觀察 對(duì)照組肉眼觀察肺組織形態(tài)正常，表面光滑呈粉紅色，邊緣銳薄，觸之質(zhì)地均勻無硬結(jié)。免疫低下組肉眼觀察肺組織表面光滑，粉紅色，邊緣銳薄，觸之質(zhì)地均勻，無硬結(jié)。感染組肉眼觀察肺組織充血，表面可見多個(gè)凸凹不平、大小不一的灰白色病灶，質(zhì)韌，第7天較第3天嚴(yán)重。

HE染色觀察(見圖1～6) 對(duì)照組HE染色顯微鏡下見肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，第3天和第7天肺組織沒有明顯的區(qū)別。免疫功能低下組HE染色顯微鏡下見肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，第3天和第7天肺組織沒有明顯的區(qū)別。感染組HE染色顯微鏡下見肺組織內(nèi)多個(gè)壞死區(qū)域，界限欠清晰，病灶之間有融合，肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔及間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 肺組織PAS染色結(jié)果

對(duì)照組和免疫低下組第3天和第7天肺組織內(nèi)均未觀察到念珠菌孢子和菌絲;感染組第3天和第7天肺組織內(nèi)可見大量念珠菌孢子(見圖7)。

2.3三組肺組織TLR2蛋白表達(dá)及比較(見圖8～13)

①感染組第3天:肺組織TLR2蛋白表達(dá)的IOD值 (3.84±0.87)×104與其他兩組比較明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)，免疫低下組肺組織TLR2蛋白表達(dá)的IOD值(2.30±0.35)×104與對(duì)照組 (2.39±0.16)×104無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。②感染組第7天:肺組織TLR2蛋白表達(dá)的IOD值 (5.06±1.32)×104與其他兩組比較明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)，免疫低下組肺組織TLR2蛋白表達(dá)的IOD值 (2.17±0.48)×104與對(duì)照組 (2.30 ±0.27)×104比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。③對(duì)照組、免疫低下組第3天與第7天組內(nèi)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05);感染組第7天TLR2表達(dá)與第3天比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)(見表1)。④三組不同時(shí)間肺組織TLR2蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:TLR2的表達(dá)以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，對(duì)照組和免疫功能低下組大鼠肺巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和少量肺泡間隔細(xì)胞胞漿有TLR2輕度表達(dá)，呈棕黃或淺黃細(xì)線型染色，局灶性散在分布。感染組肺組織內(nèi)棕褐色顆粒明顯增加。

圖1 正常組第3天HE染色(×40) 圖2 正常組第7天HE染色(×40) 圖3 免疫功能低下組第3天HE染色(×40) 圖4 免疫功能低下組第7天HE染色(×40) 圖5 感染組第3天HE染色(×40) 圖6 感染組第7天HE染色(×40) 圖7 感染組肺組織PAS染色(×200) 圖8 正常組第3天免疫組化(×40) 圖9 正常組第7天免疫組化(×40) 圖10 免疫功能低下組第3天免疫組化(×40)圖11 免疫功能低下組第7天免疫組化(×40) 圖12 感染組第3天免疫組化(×40) 圖13 感染組第7天免疫組化(×40)Fig.1 HE-stained tissue in the control group on day 3(×40)Fig.2 HE-stained tissue in the control group on day 7(×40) Fig.3 HE-stained tissue in the immunodeficiency group on day 3(×40)Fig.4 HE-stained tissue in the immunodeficiency group on day 7(×40)Fig.5 HE-stained tissue in the infected group on day 3(×40)Fig.6 HE-stained tissue in the infected group on day 7(×40) Fig.7 PAS-stained tissue in the infected group(×200)Fig.8 Immunohistochemistry-stained tissue in the control group on day 3(×40) Fig.9 Immunohistochemistry-stained tissue in the control group on day 7(×40)Fig.10 Immunohistochemistry-stained tissue in immunodeficency group on day 3(×40)Fig.11 Immunohistochemistry-stained tissue in immunodeficency group on day 7(× 40)Fig.12 Immunohistochemistry-stained tissue in the infected group on day 3(×40)Fig.13 Immunohistochemistry-stained tissue in the infected group on day 7(×40)

表1各組TLR2表達(dá)的IOD值(×104)(±s)Tab.1The IOD of TLR2 in each group(×104)(x珋±s)

表1各組TLR2表達(dá)的IOD值(×104)(±s)Tab.1The IOD of TLR2 in each group(×104)(x珋±s)

注:#.與正常組比較P ＞0.05;*.與正常組比較 P ＜0.05;★.與免疫功能低下組比較各組比較P＜0.05

組別 正常組 免疫功能低下組 感染組F 3 天組 2.39 ±0.16 2.30 ±0.35# 3.84 ±0.87＊★＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 11.515 7 天組 2.30 ±0.27 2.17 ±0.48# 5.06 ±1.32＊★ 4.830 t值 -1.426 0.184 -1.375 P值

3 討 論

Toll樣受體 (Toll-like receptors，TLRs)是重要的天然免疫模式識(shí)別受體 (Pattern recognition receptors，PPRs)。TLRs是Johnston等學(xué)者早在1984年由果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)，當(dāng)時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果蠅缺失TLRs功能時(shí)，明顯表現(xiàn)出對(duì)真菌感染的易感性，研究證明了TLRs具有介導(dǎo)抗真菌感染的重要作用［6-7］。TLRs是細(xì)胞膜表面Ⅰ型跨膜蛋白的受體，可以識(shí)別多種病原相關(guān)分子模 式 (Pathogen-associated molecular patlems，PAMPs)，通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)由髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴信號(hào)傳導(dǎo)途徑和MyD88非依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)導(dǎo)致核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子活化，引起多種炎癥介質(zhì)的合成和釋放，啟動(dòng)針對(duì)病原微生物的天然免疫和獲得性免疫。目前已發(fā)現(xiàn)TLRs家族至少有13個(gè)成員，其中TLR4和TLR2是人類TLRs家族成員中表達(dá)范圍最廣、識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子，在真菌等多種微生物所致的感染中起到重要的免疫防御等作用。

白念珠菌是寄殖人體皮膚、黏膜表面的寄生菌，一般不致病。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，口鼻咽部黏膜的定植念珠菌可以侵入支氣管或肺內(nèi)引起感染，因此念珠菌常常被稱為條件致病性真菌。念珠菌是目前院內(nèi)感染性疾病中重要的一種條件致病性真菌，念珠菌引起的深部感染，特別是肺部感染，死亡率較高。

機(jī)體免疫功能降低是導(dǎo)致念珠菌侵襲深部感染的關(guān)鍵因素，天然免疫具有監(jiān)視、識(shí)別和清除病原微生物入侵作用，是保護(hù)宿主免除感染侵害的第一道屏障。TLRs作為重要的PPRs在支氣管肺念珠菌感染時(shí)的表達(dá)以及在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中的作用值得探討。TLRs中以TLR4和 TLR2在抗真菌感染免疫的作用最為重要。TLR4在抵御真菌感染方面的作用尚有爭(zhēng)議。TLR2具有介導(dǎo)致炎因子和抑炎因子分泌的雙重作用，在對(duì)念珠菌感染的免疫調(diào)節(jié)作用還存在著廣泛的爭(zhēng)議。

本研究通過對(duì)免疫功能低下大鼠支氣管肺念珠菌感染的動(dòng)物模型的研究，觀察念珠菌支氣管肺感染時(shí)肺組織TLR2表達(dá)及其變化情況。研究結(jié)果首先看到，在感染后的第3天，大鼠肺組織無論大體肉眼外觀，還是病理切片HE染色均看到肺組織炎癥明顯，并隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥程度也在加重(感染的第7天)。在感染的第3天，肺組織的TLR2表達(dá)明顯增高，與對(duì)照組和免疫低下非感染組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;感染的第7天，肺組織的TLR2表達(dá)也隨著炎癥程度的加重而表達(dá)增高，與對(duì)照組和免疫低下非感染組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果顯示支氣管肺念珠菌感染時(shí)肺組織TLR2高表達(dá)，并隨著感染程度的加重而增高，提示了TLR2參與了支氣管肺念珠菌感染的炎癥反應(yīng)，推測(cè)TLR2的高表達(dá)可能在引起炎癥和放大炎癥中起到免疫介導(dǎo)作用。

TLR2在感染性疾病，特別在肺部感染時(shí)表達(dá)水平如何以及高表達(dá)在感染中起到保護(hù)作用還是介導(dǎo)炎癥的放大等，其研究結(jié)果不盡相同。有研究顯示:在肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠模型中，TLR2受體缺失，可見到腦內(nèi)鏈球菌清除能力明顯下降，結(jié)果導(dǎo)致腦膜炎感染的加重和提早死亡，提示TLR2高表達(dá)可以通過免疫功能殺滅鏈球菌，抵御鏈球菌感染的加重［8-9］。還有在肺炎鏈球菌肺炎的鼠模型研究中TLR2受體的缺失減弱了早期肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，但是并沒有影響肺內(nèi)肺炎鏈球菌的清除，推測(cè)肺炎鏈球菌的肺內(nèi)感染可能存在TLR2以外的受體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［10］。鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的鼠模型，TLR2基因缺失時(shí)，在炎癥的早期炎癥介質(zhì)明顯增高，之后肺內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌明顯減少，推測(cè)TLR2高表達(dá)，可能消弱肺部早期的炎癥反應(yīng)，但是阻礙肺內(nèi)細(xì)菌的清除［10］。Alves-Filho等［11］研究揭示了TLR2的高表達(dá)在細(xì)菌感染中起到負(fù)面作用。這項(xiàng)研究結(jié)果顯示:在膿毒血癥小鼠模型，將TLR2基因敲除后，能夠增強(qiáng)宿主的抗感染免疫功能，延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間。研究認(rèn)為，在膿毒血癥時(shí)，抑制或下調(diào)TLR-2的表達(dá)可以增強(qiáng)宿主的抗感染免疫能力，增加膿毒血癥的存活率［12］。TLR2在念珠菌感染時(shí)的表達(dá)和抗感染中的作用研究結(jié)果也不盡一致，有些研究認(rèn)為白念珠菌誘導(dǎo)的TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)入，是通過介導(dǎo)白介素10(infection-10，IL-10)產(chǎn)生增加和CD4+CD25+調(diào)整 T 細(xì)胞 (regulatory T cell，Treg)的增殖作用增強(qiáng)［13］，而抑制機(jī)體對(duì)于念珠菌吞噬和殺傷等免疫反應(yīng)，結(jié)果使感染加重。Treg細(xì)胞水平的增強(qiáng)可以促使播散性白念珠菌感染加重，敲除Treg細(xì)胞能夠減弱念珠菌感染的播散［14-15］。有些研究顯示，TLR2基因缺陷鼠更能夠抵御播散性白念珠菌感染，這與TLR2基因缺陷后，IL-10分泌明顯減少，Treg水平明顯降低，從而使巨噬細(xì)胞的趨化功能明顯增強(qiáng)有關(guān)［1］。Netea 等［14］研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌菌絲被TLR2識(shí)別后通過誘導(dǎo)IL-10的高分泌來抑制免疫反應(yīng)，使條件致病性念珠菌逃避機(jī)體免疫殺傷而致病。

TLR2能夠識(shí)別白念珠菌細(xì)胞壁上的β-葡聚糖，通過跨膜結(jié)構(gòu)將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子、趨化因子等釋放，參與免疫炎癥反應(yīng)［1，15］。本研究顯示白念珠菌支氣管肺感染后，肺組織TLR2呈現(xiàn)高表達(dá)，并隨著炎癥程度的加重而增高。提示在念珠菌引起的支氣管肺感染時(shí)，肺組織TLR2呈現(xiàn)高表達(dá)，TLR2的高表達(dá)可能參與念珠菌感染的炎癥反應(yīng)，在炎癥的發(fā)生和加重中起到一定的促進(jìn)作用。但是本研究?jī)H僅局限于幾只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其研究結(jié)果并不能反映人體復(fù)雜條件下真正TLR2的表達(dá)水平，而且TLR2在白念珠菌引起的支氣管肺感染中的炎癥反應(yīng)中介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)徑路，和諸多炎癥因子或致炎因子表達(dá)特點(diǎn)是相當(dāng)復(fù)雜的免疫調(diào)控過程，并且受許多因素和個(gè)體差異的影響，這些有待于今后的不斷探究。相信，隨著對(duì)于TLR2在念珠菌感染中作為非特異性免疫反應(yīng)的重要受體的作用被明確，可能成為將來治療深部念珠菌感染的新靶點(diǎn)。

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