肺腺癌和鱗癌中VEGF-C和新生淋巴管表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

代學(xué)利 王文利 申屠陽(yáng) 張杰

淋巴轉(zhuǎn)移是肺癌手術(shù)后最常見(jiàn)的擴(kuò)散途徑。近年來(lái)，肺癌VEGF-C和新生淋巴管的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系引起研究者的廣泛興趣。其中，不同病理亞型肺癌VEGF-C和新生淋巴管的表達(dá)的結(jié)果尚存爭(zhēng)議[1-3]。本文通過(guò)研究肺腺癌和鱗癌中VEGF-C和新生淋巴管表達(dá)的特征及其與患者術(shù)后生存率的相關(guān)性，以期為臨床提供有益的肺癌預(yù)后指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 患者資料

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 上海市胸科醫(yī)院胸外科1999年1月-2003年12月共行肺癌手術(shù)2,850例，入組標(biāo)準(zhǔn)：①達(dá)到肺癌完全性切除標(biāo)準(zhǔn)；②術(shù)后病理證實(shí)為IIIa（N2）期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）；③肺腺癌或鱗癌；④有完整的術(shù)后5年隨訪及生存資料。術(shù)后病理診斷不屬NSCLC或未能完全性切除者予以剔除。共計(jì)入組98例患者，其中肺鱗癌39例，肺腺癌59例。

1.1.2 資料收集 住院資料以上海市胸科醫(yī)院病案室存檔病史資料為準(zhǔn)。生存隨訪資料均來(lái)源于上海市疾病預(yù)防控制中心。所有患者均進(jìn)行腫瘤傳報(bào)。通過(guò)SPSS 13.0數(shù)據(jù)庫(kù)采集以下數(shù)據(jù)：住院號(hào)、性別、年齡、診斷時(shí)年齡、手術(shù)日期、手術(shù)類(lèi)型、病理類(lèi)型、T分期、N分期、分化程度、清掃淋巴結(jié)分期組（數(shù)）、陽(yáng)性淋巴結(jié)組，術(shù)后化療方案及周期。病理診斷根據(jù)2004年世界衛(wèi)生組織頒布的肺及胸膜腫瘤組織學(xué)分類(lèi)（第4版）標(biāo)準(zhǔn)[4]。病理分期按2009版國(guó)際抗癌聯(lián)盟肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 研究方法 統(tǒng)計(jì)分析入組患者的臨床特征及生存率，以免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)所有病灶VEGF-C和新生淋巴管的表達(dá)。比較肺腺癌和鱗癌病灶VEGF-C/新生淋巴管的表達(dá)特點(diǎn)，評(píng)價(jià)病灶VEGF-C和新生淋巴管表達(dá)的預(yù)后價(jià)值。

1.3 免疫組織化學(xué)研究

1.3.1 研究對(duì)象 收集上述98例肺癌患者術(shù)后病灶石蠟標(biāo)本，共計(jì)98塊。

1.3.2 方法及程序 采取檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)法。每例標(biāo)本切片×2，脫蠟至水。23%H2O2處理10 min，放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92oC-98oC之間并持續(xù)10 min-15 min取出容器，室溫冷卻20 min-30 min，切片先用蒸餾水沖洗兩次，再用PBS沖洗，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。VEGF-C和podoplanin一抗均為美國(guó)R&D公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品，VEGF-C為濃縮液，podoplanin為凍干粉，均用抗體稀釋液（福州邁新公司產(chǎn)品）稀釋?zhuān)琕EGF-C稀釋比為1:50配置成工作液濃度，podoplanin按說(shuō)明書(shū)加入0.2 mL抗體稀釋液稀釋為濃縮液，再按1:100稀釋比配置成工作液濃度。切片以一抗37oC溫育1 h，PBS沖洗3次。二抗為DAKO公司產(chǎn)品，加兔Envinsion室溫30 min溫育，PBS沖洗3次。滴加新鮮配制DAB顯色液（DAKO公司產(chǎn)品），顯微鏡下觀察5 min-10 min，在顯色最佳時(shí)用PBS沖洗，中止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，然后水洗、藍(lán)化、脫水、中性樹(shù)膠封片。

1.3.3 VEGF-C表達(dá)的觀察和計(jì)量 應(yīng)用日本產(chǎn)Olympus BX51光電顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察。VEGF-C在癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)顯示胞漿或細(xì)胞膜上有黃色或棕黃色顆粒。先在×40倍下觀察整體著色情況，繼而在×100倍下確定染色區(qū)域，再在×200倍下應(yīng)用Leica Qwin320 plus圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像檢測(cè)。病灶VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比計(jì)分方法：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%-50%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為3分。病灶VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。以上述百分比計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積獲得VEGF-C表達(dá)的等級(jí)：0分-2分為（-），3分-4分為（+），5分-7分為（++），8分-9分為（+++）。統(tǒng)計(jì)每一級(jí)別例數(shù)，以等級(jí)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.4 新生淋巴管表達(dá)的觀察和計(jì)量 應(yīng)用日本產(chǎn)Olympus BX51光電顯微鏡進(jìn)行觀察。先在×40倍下觀察整體著色情況，在×100倍下確定“熱點(diǎn)”區(qū)，即淋巴管密度最高處，在×200倍下進(jìn)一步區(qū)分著色情況，剔除因成纖維細(xì)胞染色而選取的細(xì)胞間質(zhì)。新生淋巴管的確定條件為：podoplanin染色為黃色扁平樣、單層管壁無(wú)肌細(xì)胞和周細(xì)胞、管腔內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞出現(xiàn)。單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞著色亦作為一個(gè)計(jì)數(shù)單位，不以是否形成管腔和管腔內(nèi)有無(wú)淋巴細(xì)胞作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。然后在×400倍視野下選擇5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)數(shù)，計(jì)算每例切片單位視野平均新生淋巴管數(shù)，以微淋巴管密度值表示（lymph microvessel density,LMVD），單位為個(gè)。以Mean±SD表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。定量資料的分析采用t檢驗(yàn)，率或構(gòu)成比分析采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier乘積法和Log-rank檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C的表達(dá)及其與病理因素的關(guān)系 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色顆粒（圖1）。98例患者中，共計(jì)58例（59.2%）的VEGF-C呈陽(yáng)性表達(dá)。其中腺癌組表達(dá)陽(yáng)性率（71.2%）明顯高于鱗癌組（41.0%）（P=0.003）（表1）。VEGF-C的表達(dá)與病理類(lèi)型相關(guān)，而與T分期、腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)（表2）。

2.2 肺腺癌和鱗癌中新生淋巴管的表達(dá)及其與病理因素的關(guān)系 新生淋巴管非均勻分布于腫瘤組織，大部分出現(xiàn)在腫瘤邊緣，而腫瘤內(nèi)的淋巴管大多塌陷（圖2）。新生淋巴管表達(dá)數(shù)量以微淋巴管密度值LMVD表示，98例患者中LMVD為（5.00±4.13）個(gè)，其中腺癌（6.20±3.81）個(gè)，鱗癌（3.95±3.18）個(gè)。VEGF-C的表達(dá)與病理類(lèi)型有關(guān)，而與T分期、腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)（表2）。

2.3 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C表達(dá)與新生淋巴管的關(guān)系98例病灶中，VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)為58例，LMVD為（7.67±3.10）個(gè)；VEGF-C陰性表達(dá)為40例，LMVD為（1.52±1.13）個(gè)。VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性和陰性者的LMVD間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=12.35, P＜0.01）。98例病灶中VEGF-C的表達(dá)與LMVD相關(guān)（r=0.749, P＜0.01）。

2.4 生存分析 98例患者的總體5年生存率為38.8%（38/98），中位生存期為（37.53±4.05）個(gè)月，肺鱗癌組5年生存率為46.2%（18/39），腺癌組為33.9%（20/59），兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.273）。

2.4.1 單因素分析 VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性患者58例，陰性40例，兩者的中位生存期分別為（21.53±2.98）個(gè)月和（55.3±4.05）個(gè)月， VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性者預(yù)后較差（χ2=35.48, P=0.001）（圖3A）。如將患者分為高LMVD組（≥5個(gè)）和低LMVD組（＜5個(gè)），則兩者的中位生存期分別為（21.23±2.22）個(gè)月和（53.74±3.24）個(gè)月，高LMVD者預(yù)后較差（χ2=35.48, P=0.001）（圖3B）。

2.4.2 多因素分析 采用Cox模型對(duì)患者年齡、性別、T分期、腫瘤直徑、病理類(lèi)型、分化程度、VEGF-C表達(dá)及LMVD進(jìn)行多因素分析，發(fā)現(xiàn)僅病灶VEGF-C表達(dá)是影響患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因素（表3）。

表1 肺腺癌（A）和鱗癌（B）中VEGF-C的表達(dá)Tab 1 The expression of VEGF-C in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma

表2 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C和新生淋巴管的表達(dá)與病理因素的關(guān)系Tab 2 The relationship between VEGF-C/lymphangiogenesis expression and pathologic factors

圖1 免疫組化法檢測(cè)肺腺癌（A）和鱗癌（B）中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C （VEGF-C）的陽(yáng)性表達(dá)（×100）。Fig 1 The positive expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) in lung adenocarcinoma (A) and squamous cell carcinoma (B) by immunohistochemistry (×100).

圖2 免疫組化法檢測(cè)肺腺癌和鱗癌中新生淋巴管的表達(dá)。A：紅色橢圓形區(qū)域?yàn)樾律馨凸鼙磉_(dá)區(qū)域（×100）；B：紅色箭頭所指為新生淋巴管（×200）。Fig 2 The expression of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma by immunohistochemistry. A: The red elliptical area showed the expression of lymphangiogenesis (×100); B: The red arrow showed the the expression of lymphangiogenesis (×200).

圖3 Kaplan-Meier累計(jì)生存時(shí)間曲線分析。A：VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)患者和陰性表達(dá)患者的Kaplan-Meier累計(jì)生存時(shí)間曲線；B：高LMVD組患者和低LMVD組患者的Kaplan-Meier累計(jì)生存時(shí)間曲線。Fig3 Kaplan-Meier cumulative survival time curves analysis. A: Kaplan-Meier cumulative survival time curves of VEGF-C positive expression group and VEGF-C negative expression group; B: Kaplan-Meier cumulative survival time curves of higher LMVD (≥5) and lower LMVD (＜5).

表3 肺腺癌和鱗癌患者生存期的預(yù)后因素（Cox回歸分析）Tab 3 Prognostic factors for survival in patients with lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma (Cox regression model)

3 討論

早期肺癌患者手術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達(dá)60%，成為術(shù)后遠(yuǎn)期死亡的重要原因，并最終影響總體療效[5]。介導(dǎo)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要途徑是淋巴和血行，以淋巴轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)。由于淋巴管的基底膜薄且不連續(xù)，不能對(duì)腫瘤細(xì)胞構(gòu)成有效屏障，因此腫瘤細(xì)胞易于侵入淋巴管，此外，新生淋巴管也可從外部長(zhǎng)入腫瘤內(nèi)部，使腫瘤細(xì)胞被動(dòng)進(jìn)入新生淋巴管內(nèi)[4]。

隨著近年來(lái)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的逐漸發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究有了明顯的進(jìn)展[6]。Podoplanin是在腎小球足狀突細(xì)胞首先證實(shí)的一種整合胞質(zhì)胞膜粘蛋白，一度認(rèn)為，除皮膚某些血管內(nèi)皮細(xì)胞外，podoplanin只表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮，后發(fā)現(xiàn)其在I型肺泡上皮、乳腺肌上皮及食管、肺、肝、直腸和乳腺來(lái)源的癌細(xì)胞上亦有表達(dá)[7]。但相比于曾廣泛應(yīng)用的VEGFR-3和LYVE-1，由于podoplanin在正常肺組織及肺癌病灶的血管內(nèi)皮上無(wú)表達(dá)，因而新生淋巴管易于甄別，迄今仍是相對(duì)準(zhǔn)確的新生淋巴管標(biāo)記物。

VEGF是一個(gè)細(xì)胞因子家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子等。VEGF-C的受體有兩個(gè)：VEGFR-2和VEGFR-3，均屬于酪氨酸激酶受體，特異性地存在于內(nèi)皮細(xì)胞。相關(guān)研究[8,9]顯示，VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合可發(fā)揮明顯、特異的促淋巴管生成作用，同一組織中VEGF-C與VEGFR-3的結(jié)合力是VEGFR-2的3倍，使得VEGF-C的促淋巴管生成作用成為主導(dǎo)，是促進(jìn)淋巴管新生最重要的因子。腫瘤組織中過(guò)表達(dá)的VEGF-C不僅誘導(dǎo)淋巴管的新生，而且使腫瘤組織外周淋巴管直徑增加，增加了腫瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸面積，可能籍此增加腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。本研究顯示，對(duì)IIIa（N2）期患者而言，隨著VEGF-C表達(dá)的增強(qiáng)，新生淋巴管的數(shù)量也逐漸增加，且VEGF-C表達(dá)者新生淋巴管的數(shù)量明顯高于無(wú)表達(dá)者，VEGF-C的表達(dá)與新生淋巴管之間存在正相關(guān)性，提示腫瘤組織中VEGF-C的表達(dá)可能促進(jìn)新生淋巴管的生成。有研究[10]認(rèn)為VEGF-C促進(jìn)NSCLC的淋巴管生成，有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移，盡管存在異議[11]，但作者支持前述新生淋巴管的分子機(jī)制。

有研究[12,13]報(bào)道，肺癌病灶VEGF-C表達(dá)與患者淋巴轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病灶邊緣淋巴管密度明顯升高，新生淋巴管可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子。在生存分析的研究中，多數(shù)提示VEGF-C是影響預(yù)后的因素[12-15]。此外，有學(xué)者[13]報(bào)道病灶VEGF-C的表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴系統(tǒng)受侵呈正相關(guān)；而病灶淋巴管密度則與VEGF-C表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)，認(rèn)為VEGF-C的表達(dá)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。本研究的單因素分析中，病灶VEGF-C表達(dá)患者與無(wú)表達(dá)者的中位生存期差距明顯，VEGF-C表達(dá)者預(yù)后較差。多因素分析亦顯示病灶VEGF-C表達(dá)是影響患者生存的獨(dú)立因素，與前述報(bào)道結(jié)論一致，可能與VEGF-C的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此VEGF-C的高表達(dá)可作為肺癌的高危預(yù)測(cè)因素。對(duì)于病灶新生淋巴管表達(dá)，本研究?jī)H單因素分析提示高表達(dá)組的中位生存期明顯低于低表達(dá)組，新生淋巴管數(shù)量較多者預(yù)后較差，但多因素分析并未顯示新生淋巴管密度是獨(dú)立的預(yù)后影響因素。有研究[11]認(rèn)為，肺癌患者本身所具有的淋巴管在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用比新生淋巴管更重要，新生淋巴管可能起到了促進(jìn)腫瘤向正常淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌的微血管密度明顯高于肺鱗癌[16]，但是有關(guān)肺腺、鱗癌新生淋巴管的差異結(jié)論不一[1-3]。本研究中，腺癌病灶VEGF-C表達(dá)率（71.2%）明顯高于鱗癌組（41.0%）（P=0.003），腺癌病灶新生淋巴管密度平均為（6.20±3.81）個(gè)，亦明顯高于鱗癌組（3.95±3.18）個(gè)（P=0.001)，且二者與患者年齡、性別、T分期及腫瘤分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。本研究提示肺腺癌VEGF-C的高表達(dá)，可能較肺鱗癌更明顯促進(jìn)新生淋巴管的生成，使癌細(xì)胞經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)率更高，從而影響患者的術(shù)后效果。至于兩組之間并無(wú)明顯生存差異，可能因本研究以IIIa期患者為研究對(duì)象，患者已然出現(xiàn)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示肺癌晚期（IIIa）期患者病理分型并非影響生存率的主要因素，這也從另一個(gè)側(cè)面印證了病理分期對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。當(dāng)然，由于兩組病例數(shù)存在明顯傾斜（腺癌59例 vs 鱗癌39例）且總體病例數(shù)有限，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

肺癌2009新的國(guó)際分期將腫瘤直徑≥7 cm者劃歸為T(mén)3，預(yù)后明顯差于腫瘤直徑較小者。本研究雖未發(fā)現(xiàn)≥7 cm腫瘤VEGF-C和新生淋巴管的明顯高表達(dá)，可見(jiàn)腫瘤直徑的增大并未促進(jìn)VEGF-C和新生淋巴管的表達(dá)，但須提及的是，本研究中腫瘤直徑≥7 cm的比例較低（10/98），而其VEGF-C的表達(dá)率卻明顯高于腫瘤直徑＜7 cm者（70% vs 58%），而且LMVD亦較高（6.60±5.46 vs 4.82±3.95），因此，亦有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量才能獲得更為可信結(jié)論。