螺內(nèi)酯對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及 TGF-β1、FN 分泌的影響

郭曉理，朱雋雅，施 輝*，王德琴，徐美玉

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001;2海安縣人民醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)常見并發(fā)癥，其主要的病理改變是腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)增殖及異常增多，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是其病理改變的主要介導(dǎo)物，不僅可上調(diào)ECM蛋白表達(dá)，還可降低ECM蛋白降解酶的活性。ECM的主要成分是FN，F(xiàn)N增多是ECM過度沉積的標(biāo)志。2009年9月～2010年3月，本研究觀察了高糖刺激對(duì)大鼠GMCs增殖的影響，并進(jìn)一步觀察了螺內(nèi)酯干預(yù)后對(duì)大鼠GMCs增殖及TGF-β1、FN分泌的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠GMCs購自上海長征醫(yī)院腎內(nèi)科。低糖、高糖DMEM培養(yǎng)液，青—鏈霉素組合雙抗為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。0.25%胰蛋白酶，24孔、96孔培養(yǎng)板為碧云天公司產(chǎn)品。螺內(nèi)酯、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(MTT)為Amresco產(chǎn)品，ELISA試劑盒由博士德提供。Thermo MK3酶標(biāo)儀為美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠GMCs培養(yǎng) 大鼠 GMCs常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中，置37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長期GMCs用于實(shí)驗(yàn)。分組:①低糖(5.5 mmol/L)對(duì)照組(LG組);②高糖(25 mmol/L)對(duì)照組(HG組);③SPI1 組(HG+0.25 μmol/L 螺內(nèi)酯);④SPI2組(HG+2.5 μmol/L 螺內(nèi)酯);⑤SPI3 組(HG+25 μmol/L螺內(nèi)酯);⑥SPI4 組(HG+50 μmol/L 螺內(nèi)酯)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠 GMCs增殖的影響 采用MTT法。調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，將GMCs接種于96 孔板，每孔 200 μl。分別培養(yǎng) 12、24、48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入20 μl的MTT溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h棄上清，加入150 μl的DMSO振蕩。用酶標(biāo)儀(波長490 nm)測(cè)定OD值。

1.2.3 TGF-β1、FN 的檢測(cè) 采用 ELISA 法。調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml，將 GMCs接種于24孔板，每孔1000 μl。培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)不同濃度螺內(nèi)酯作用后 TGF-β1、FN 的含量。并檢測(cè) 25 μmol/L螺內(nèi)酯作用12、24、48 h 時(shí) TGF-β1、FN 的含量。操作過程嚴(yán)格按ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 螺內(nèi)酯對(duì)各組大鼠GMCs增殖的影響 見表1。

表1 各組大鼠GMCs增殖比較(n=6，)

表1 各組大鼠GMCs增殖比較(n=6，)

注:與 NG 組比較，*P ＜0.05;與 HG 組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01;與同組12 h比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與同組24 h比較，●P ＜0.05，●●P ＜0.01;同一時(shí)間各組間比較，#P ＜0.05

組別GMCs增殖OD值12 h 24 h 48 h NG組0.521 ±0.0554 0.523 ±0.0687 0.560 ±0.0262 HG 組 0.592 ±0.0591 0.601 ±0.0455*# 0.614 ±0.0362*#SPI1 組 0.592 ±0.0142 0.510 ±0.0880△# 0.423 ±0.0159△△▲▲●#SPI2 組 0.521 ±0.0142# 0.417 ±0.0251△# 0.364 ±0.0453△△▲▲●#SPI3 組 0.436 ±0.0533△△# 0.363 ±0.0506△△# 0.291 ±0.0380△△▲▲●#SPI4 組 0.354 ±0.0330△△# 0.287 ±0.0499△△# 0.209 ±0.0320△△▲●●#

2.2 螺內(nèi)酯對(duì)TGF-β1、FN分泌的影響 見表2、3。

表2 各組培養(yǎng)24 h TGF-β1、FN含量比較(n=6，ng/ml，)

表2 各組培養(yǎng)24 h TGF-β1、FN含量比較(n=6，ng/ml，)

注:與 NG 組比較，*P ＜0.01;與 HG 組比較，△P ＜0.01;各濃度組后一濃度與前一濃度比較，#P ＜0.01，##P ＜0.05

組別 TGF-β1FN NG組0.55 ±0.04 74.5 ±8.9 HG 組 1.03 ±0.03* 118.8 ±6.1*SPI1 組 0.98 ±0.07 103.4 ±7.3△#SPI2 組 0.62 ±0.05△# 81.6 ±6.5△#SPI3 組 0.44 ±0.08△# 68.9 ±5.4△#SPI4 組 0.35 ±0.03△## 51.1 ±6.2△#

表 3 25 μmol/L 螺內(nèi)酯作用 12、24、48 h TGF-β1、FN含量比較(ng/ml，)

表 3 25 μmol/L 螺內(nèi)酯作用 12、24、48 h TGF-β1、FN含量比較(ng/ml，)

注:各時(shí)間組后一時(shí)間組與前一時(shí)間組比較，*P＜0.01，＊＊P＜0.05

檢測(cè)項(xiàng)目 25 μmol/L螺內(nèi)酯作用12 h 24 h 48 h TGF-β1 0.69 ±0.06 0.44 ±0.08* 0.34 ±0.05＊＊FN 80.70 ±9.20 68.90 ±5.40＊＊ 60.10 ±7.80＊＊

3 討論

GMCs增殖是DN突出的病理學(xué)特征，是引起腎小球ECM增多，并進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化的重要原因。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)在腎臟纖維化中起著重要作用，但醛固酮的作用一直被忽視。有研究顯示，醛固酮可不依賴于腎素—血管緊張素的效應(yīng)引起靶器官和血管損傷、纖維化。醛固酮可通過 TGF-β1、鈉氫交換子 1 等誘導(dǎo) ECM 增生［1，2］。螺內(nèi)酯是醛固酮受體拮抗劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與醛固酮類似，是醛固酮的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，有弱效利尿作用。近年研究證明，醛固酮也是腎纖維化過程中一個(gè)重要因素。因而，螺內(nèi)酯具有預(yù)防和減輕腎臟纖維化的作用［3，4］，能下調(diào) TGF-β1，減少Ⅰ型膠原的沉積和FN的分泌，減輕了小管間質(zhì)纖維化［5］。

正常生理情況下，ECM處于不斷產(chǎn)生和降解的動(dòng)態(tài)平衡中。GMCs增殖后，可導(dǎo)致 ECM大量分泌，而ECM對(duì)GMCs有正反饋?zhàn)饔?，以致這類物質(zhì)在基質(zhì)中聚集增多［6］。當(dāng)各種損傷因子和有害成分如高糖、細(xì)胞因子等出現(xiàn)或發(fā)生改變時(shí)，以上的平衡被打亂，GMCs的形態(tài)和功能發(fā)生改變，細(xì)胞因子和ECM分泌增多［7］。本研究結(jié)果表明，高糖環(huán)境下GMCs增殖明顯，ECM分泌增多。使用螺內(nèi)酯干預(yù)后增殖受到抑制，基質(zhì)分泌減少，且呈劑量依賴性。其原因可能與螺內(nèi)酯能下調(diào)TGF-β1等細(xì)胞因子水平有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，體外高糖環(huán)境對(duì)GMCs的生長具有雙重作用，早期可以刺激細(xì)胞增殖，48 h后則抑制細(xì)胞增殖［8］。本研究將25 mmol/L葡萄糖作用于GMCs發(fā)現(xiàn)，48 h內(nèi)可促進(jìn)GMCs的增殖，未出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的抑制作用，與報(bào)道相符，并隨作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖越明顯，具有時(shí)間依賴性。

綜上所述，螺內(nèi)酯可以抑制高糖誘導(dǎo)的GMCs增殖及ECM的分泌，為螺內(nèi)酯防治DN提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但螺內(nèi)酯長期使用會(huì)引起水、電解質(zhì)平衡紊亂，雖然本實(shí)驗(yàn)無明顯的細(xì)胞損傷，若長期使用，有待進(jìn)一步研究。

［1］賴凌云，顧勇，郁勝強(qiáng)，等.醛固酮通過Smad2依賴的轉(zhuǎn)化生長因子-β1途徑刺激大鼠系膜細(xì)胞纖連蛋白合成［J］.中華腎臟病雜志，2005，21(3):153-156.

［2］張敏敏，顧勇，賴凌云，等.醛固酮可通過鈉氫交換子1誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)增生［J］.中華腎臟病雜志，2006，22(8):477-482.

［3］Epstein M.Aldosterone as a mediator of progressive renal dysfunction:evolving perspectives［J］.Intern Med，2001，40(7):573-583.

［4］Mehdi UF，Adams-Huet B，Raskin P，et al.Addition of angiotensin receptor blockade or mineralocorticoid antagonism to maximal angiotensin-converting enzyme inhibition in diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(12):2641-2650.

［5］Feria I，Pichardo I，Juarez P，et al.Therapeutic benefit of spironolactone in experimental chronic cyclosporine a nephrotoxicity［J］.Kidney Int，2003，63(1):43-52.

［6］Floege J，Johnson RJ，Gordon K，et al.Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis［J］.Kidney Int，1991，40(3):477-488.

［7］房輝，徐剛，于德民，等.TGF-β1和ECM與糖尿病腎病關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國糖尿病雜志，2000，8(4):227-230.

［8］Wolf G，Sharma K，Chen Y，et al.High glucose induced proliferation in mesangial cells is reversed by autocrine TGF-beta［J］.Kindney Int，1992，42(3):647-656.