原代自體表皮細(xì)胞懸液移植對(duì)燒傷大鼠的治療作用

王曉曄，左海亮，崔華雷

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

表皮細(xì)胞的損傷是皮膚損傷的起始和病理生理基礎(chǔ)。關(guān)于表皮細(xì)胞移植治療深度燒傷，文獻(xiàn)報(bào)道各有不同，對(duì)表皮細(xì)胞的移植密度尚無明確定論。2009年1～7月，我們進(jìn)行了不同密度原代自體表皮細(xì)胞的移植，觀察治療燒傷的效果，探討最佳的表皮細(xì)胞移植密度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(130±10)g。隨機(jī)分為A組(移植密度6.0×104/cm2)、B組(移植密度 1.2×105/cm2)、C組(移植密度2.4×105/cm2)和 D 組(對(duì)照組)，每組15只。

1.2 燒傷模型的制作 大鼠術(shù)前禁食6 h，腹部皮膚消毒后，予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，剔除背部鼠毛，形成約2 cm×2 cm無毛區(qū)，用膠帶粘貼四周。將大鼠側(cè)放懸空，無毛區(qū)暴露充分。用95℃熱水，直接傾倒于無毛區(qū)，時(shí)間約40 s，造成Ⅲ度燒傷模型(病理檢查確定燒傷程度)。傷后10 min，生理鹽水10 ml腹腔注射。單籠飼養(yǎng)，每日予氨芐青霉素4萬U肌注。每日傷口清潔消毒。

1.3 自體表皮細(xì)胞制備 燒傷模型制作后第3天，在同一只大鼠腹部皮膚消毒后，予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，于其大鼠背部(與燒傷區(qū)域不同)消毒剃毛后分別選擇0.8 cm ×0.5 cm 小塊面積取皮，共約 2 cm2，皮膚缺損部位用縫皮針線縫合。獲取的皮膚在0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA中消化16 h下消化，消化方法為冷消化法和真皮刮除法，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)。制備成密度為1×106個(gè)/ml表皮細(xì)胞懸液備用。

1.4 移植密度和方法 于燒傷后第4天切痂，用移液器調(diào)整好所需要的劑量分別移植，液量不足240 μl的用培養(yǎng)液補(bǔ)足。

1.5 指標(biāo)觀察 移植后的創(chuàng)面是否發(fā)生感染，發(fā)生感染的例數(shù)，各組創(chuàng)面情況、愈合情況、創(chuàng)面?zhèn)诘氖湛s比例等。創(chuàng)面收縮比例計(jì)算參照紙片模板法，并根據(jù)實(shí)際情況作相應(yīng)調(diào)整。收縮比例=(1－愈合后面積/原始創(chuàng)面面積)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，瘢痕愈合數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，收縮比例數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

移植的30只大鼠中，A組成活14只，死亡1只;B組成活14只，感染導(dǎo)致移植失敗1只;C組成活14只，感染導(dǎo)致移植失敗1只;D組(對(duì)照組)均成活。

移植后第3天開始出現(xiàn)針尖樣皮島，散在分布。C組最多，B組次之，A組最少，D組未見皮島。各創(chuàng)面均有滲出，有軟結(jié)痂形成的趨勢(shì)。皮島在隨后的幾天中逐漸擴(kuò)大，類似集落樣向四周擴(kuò)展，至相互接觸。創(chuàng)面逐漸由不平整向光滑發(fā)展，A組明顯較B組和C組慢，B組和C組未見明顯差異。第7～11天B組和C組創(chuàng)面表面光滑、平整，紅潤(rùn)有光澤;A組創(chuàng)面表面不平整，紅潤(rùn)有光澤;D組創(chuàng)面瘢痕，凹凸不平。第12～17天B組和C組創(chuàng)面顏色逐漸由紅潤(rùn)變得與周圍膚色相近;A組創(chuàng)面也漸變平整，顏色逐漸由紅潤(rùn)變得與周圍膚色相近;D組創(chuàng)面收縮嚴(yán)重;第18～21天各組創(chuàng)面基本無變化，治療組創(chuàng)面平整形成生理性愈合，對(duì)照組創(chuàng)面不平整，瘢痕愈合。各組瘢痕愈合例數(shù)及創(chuàng)面收縮比例見表1。

表1 不同移植密度愈合情況

3 討論

目前細(xì)胞移植封閉治療燒傷創(chuàng)面的方法和類型有多種:自體表皮細(xì)胞移植、異體表皮細(xì)胞移植、自—異體表皮細(xì)胞移植［1］、自體間充質(zhì)細(xì)胞移植［2，3］。異體和自—異體表皮細(xì)胞移植采用異體細(xì)胞，由于免疫排斥反應(yīng)的存在，只能暫時(shí)封閉創(chuàng)面，異體細(xì)胞最終脫落，創(chuàng)面再次暴露［4］，并且增加感染和瘢痕愈合的風(fēng)險(xiǎn)，不是細(xì)胞移植的首選方法。自體表皮細(xì)胞移植是治療深度燒傷和皮膚缺損類疾病的根本途徑，既維持了表皮封閉創(chuàng)面的保護(hù)組織、機(jī)械屏障的功能，又無瘢痕形成，創(chuàng)口收縮不明顯，這樣就可保持正常的皮膚形態(tài)和功能。

自體細(xì)胞移植可分為原代自體細(xì)胞移植和傳代自體細(xì)胞移植。近幾年來實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，原代自體表皮細(xì)胞移植有良好的治療效果［5，6］:①可以盡早應(yīng)用于臨床，封閉切痂后的創(chuàng)面。②縮短燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間。通過種植細(xì)胞的直接成活和再生，可以快速促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合，進(jìn)而減少各種并發(fā)癥的發(fā)生。③擴(kuò)增倍數(shù)大。④與基底面結(jié)合牢固［7］。⑤創(chuàng)面愈合好，瘢痕形成少，甚至無瘢痕形成。

對(duì)移植密度的測(cè)算，我們?cè)O(shè)計(jì)了6.0×104/cm2、1.2 ×105/cm2、2.4 ×105/cm2三個(gè)梯度移植密度。結(jié)果表明，在表皮細(xì)胞移植后第3天創(chuàng)面可見散在針尖樣白點(diǎn)——皮島，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，皮島的面積在不斷擴(kuò)大。此時(shí)基底部滲出物形成一層半透明的膜狀物，并可于其下發(fā)現(xiàn)淡紅色線條，考慮為微毛細(xì)血管的增生，組織切片HE染色證實(shí)。半透明狀物逐漸變?yōu)椴煌该鳎紤]一方面是表皮細(xì)胞增殖分化形成復(fù)層結(jié)構(gòu);另一方面是肉芽組織增生，纖維組織日益增多。但是畢竟表皮層尚不完全，此時(shí)的膜逐漸變?yōu)榈t色，仍考慮為基底部毛細(xì)血管長(zhǎng)入。隨著時(shí)間變化，創(chuàng)面的顏色又逐漸變?yōu)榘咨?。因此，移植密?.2×105/cm2和2.4×105/cm2在瘢痕愈合的數(shù)量上是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，移植密度在1.2×105/cm2即可達(dá)到要求。

另外，創(chuàng)面收縮是愈合過程中正常和必須的過程［8］，其中傷口收縮是加速傷口愈合的重要環(huán)節(jié)，但是過度地收縮則會(huì)導(dǎo)致攣縮的發(fā)生，引起嚴(yán)重的外形與功能障礙。本研究結(jié)果表明，無論治療組還是對(duì)照組均存在一定程度的創(chuàng)口收縮，通過測(cè)量愈合后的面積發(fā)現(xiàn)，治療組均存在創(chuàng)口收縮的問題，但是收縮的程度不同。其中，移植密度為1.2×105/cm2和2.4×105/cm2在傷口收縮面積上是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。因此，移植密度1.2×105/cm2是比較適宜的移植密度。

綜上所述，原代自體表皮細(xì)胞移植具有快速、簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是一種治療深度燒傷和皮膚缺損類疾病的良好手段。

［1］Xiao S，Zhu S，Li H，et al.Feasibility study of composite skin reconstructed by mixing keratinocytes and acellular dermal matrix for wound repair［J］.Swiss Med Wkly，2009，139(1-2):16-21.

［2］Kim SS，Song CK，Shon SK，et al.Effects of human amniotic membrane grafts combined with marrow mesenchymal stem cells on healing of full-thickness skin defects in rabbits［J］.Cell Tissue Res，2009，336(1):59-66.

［3］Riekstina U，Muceniece R，Cakstina I，et al.Characterization of human skin-derived mesenchymal stem cell proliferation rate in different growth conditions［J］.Cytotechnology，2008，58(3):153-162.

［4］Drewa T，Nadolski B，Czaplewski A，et al.Application of autologous and allogenic keratynocyte cultures in burn management［J］.Przegl Lek，2005，62(9):934-937.

［5］Wood FM，Stoner ML，F(xiàn)owler BV，et al.The use of a non-cultured autologous cell suspension and integra dermal regeneration template to repair full-thickness skin wounds in porcine model:a one-step process［J］.Burns，2007，33(6):693-700.

［6］呂國(guó)忠，朱宇剛，周紅梅，等.大鼠自體異體表皮細(xì)胞懸液混合移植到實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華燒傷雜志，2003，19(1):29-31.

［7］王珍祥，吳軍，李世榮.放射治療瘢痕攣縮的生物學(xué)機(jī)制［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2001，5(12):35-36.

［8］Gravante G，Di Fede MC，Araco A，et al.A randomized trial comparing ReCell system of epidermal cells delivery versus classic skin grafts for the treatment of deep partial thickness burns［J］.Burns，2007，33(8):996-972.