一個(gè)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體的培養(yǎng)基優(yōu)化

李建政，高晨晨，2，張立國(guó)，劉 崇，金 羽，張 巖

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱，ljz6677@163.com;2.國(guó)家城市給水排水工程技術(shù)研究中心，300074天津)

傳統(tǒng)理論認(rèn)為，產(chǎn)甲烷階段是厭氧消化的限制步驟[1].然而，有研究表明，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝對(duì)厭氧消化過(guò)程的限制作用要大于產(chǎn)甲烷菌群的產(chǎn)甲烷代謝[2－3]，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌代謝活性的增強(qiáng)，有望使厭氧生物處理系統(tǒng)的效能得到顯著提高[4－5].向厭氧生物處理系統(tǒng)中投加產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌或產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體則是達(dá)到這一目的的有效手段之一.產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌對(duì)生長(zhǎng)條件有較嚴(yán)格的要求，其純培養(yǎng)物很難得到[6－7].比較而言，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體的篩選和培養(yǎng)則相對(duì)容易.然而，目前關(guān)于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體的研究報(bào)道還十分匱乏[8－11]，如何有效地篩選和培養(yǎng)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體是需要解決的首要問(wèn)題.在前期研究中[12]，以處理高質(zhì)量濃度有機(jī)廢水的厭氧折流板反應(yīng)器(ABR)中的活性污泥為樣品，分離得到一種產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸共培養(yǎng)體7－m－2a.本文從產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的生理生態(tài)習(xí)性入手，研究了7－m－2a在不同碳源、氮源及不同質(zhì)量濃度泛酸、鈣、鐵、鎂離子條件下的生長(zhǎng)代謝狀況，優(yōu)化了培養(yǎng)基，為其擴(kuò)大培養(yǎng)并從中分純產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌株奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種及其來(lái)源

研究采用的產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7－m－2a，是以丙酸為底物的選擇性培養(yǎng)基，從本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的ABR厭氧活性污泥中分離得到，對(duì)丙酸具有較強(qiáng)的降解和轉(zhuǎn)化能力.該共培養(yǎng)體含有氧化丙酸的專性互營(yíng)質(zhì)子還原菌Desulfotomaculum sp.Iso－W2，其伴生菌是能利用甲酸鹽和H2/CO2的Uncultured bacterium 054E12－B－DI－P58 和Sedimentibacter sp.JN18－A14－H.

1.2 培養(yǎng)基

其中，微量元素液(1 L):MnSO4·7H2O 0.01 g，ZnSO4·0.2 g，AlK(SO4)20.01 g;維生素液(1 L):鈷氨素0.01 g，抗壞血酸 0.025 g，核黃素 0.025 g，檸檬酸0.02 g，吡多醛 0.05 g，葉酸 0.01 g，對(duì)氨基苯甲酸 0.01 g，肌酸 0.025 g，刃天青(0.2%)0.2 mL，半胱氨酸 1 g，pH 7.0.

丙酸質(zhì)量濃度梯度培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的丙酸鈉質(zhì)量濃度為 2.5、5、10、15、20、25 g/L，其他成分不變.

酵母膏培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和NH4Cl去除，其他成分不變.胰蛋白胨培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母膏和NH4Cl去除，其他成分不變.胰蛋白胨－酵母膏培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母膏和胰蛋白胨質(zhì)量濃度都調(diào)節(jié)為0.5 g/L，同時(shí)去除NH4Cl，其他成分不變.氯化銨培養(yǎng)基:去除基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母膏和胰蛋白胨，其他成分不變.復(fù)合氮源培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的胰蛋白胨、酵母膏和 NH4Cl用量均調(diào)節(jié)為0.33 g/L，其他成分不變.

鐵離子培養(yǎng)基:向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中投加一定量的FeC12配制而成.培養(yǎng)基中的Fe2+質(zhì)量濃度，根據(jù)研究需要分別調(diào)節(jié)為 44、66、88、110和132 mg/L.無(wú)鈣培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的CaCl2去除，其他成分不變.鎂離子培養(yǎng)基:向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中投加一定量的MgCl2配制而成，培養(yǎng)基中的Mg2+質(zhì)量濃度，根據(jù)研究需要分別調(diào)節(jié)為13、25、38、50和63 mg/L.泛酸培養(yǎng)基:向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中投加一定量的泛酸，根據(jù)研究需要，將其質(zhì)量濃度分別調(diào)節(jié)為10、20、30、40 和 50 mg/L.

1.3 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法

取容積為25 mL的厭氧管，注入10 mL的液體培養(yǎng)基，充氮脫氧，封蓋，滅菌;在超凈工作臺(tái)(SW－CJ－1G，蘇州凈化設(shè)備有限公司)上，用無(wú)菌注射器取7－m－2a菌懸液(OD600nm為0.8左右)3 mL接種;置于恒溫培養(yǎng)箱(PYX－DHS，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)中38℃培養(yǎng)30 d.每個(gè)培養(yǎng)條件均采用3只厭氧管進(jìn)行平行試驗(yàn).

1.4 分析項(xiàng)目與方法

pH采用PHS－25型酸度計(jì)測(cè)定.發(fā)酵氣產(chǎn)量采用注射器釋放并劑量，液相末端產(chǎn)物和發(fā)酵氣成分采用氣相色譜儀檢測(cè)[4].菌懸液細(xì)胞密度采用UV2300型分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，以未接種的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度(OD).反應(yīng)混合液的OD值用于反映菌體的增殖情況.

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

生長(zhǎng)代謝指標(biāo)乙酸產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)量、丙酸降解速率以及OD600nm均取3個(gè)平行測(cè)試的平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差采用excel軟件中的STDEV函數(shù)計(jì)算.

其中，乙酸產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)量和OD600nm均為培養(yǎng)30 d后的檢測(cè)值減去初始時(shí)刻的檢測(cè)值，而丙酸降解速率則以丙酸累積消耗量除以培養(yǎng)時(shí)間30 d而獲得.

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酸質(zhì)量濃度對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的丙酸鈉質(zhì)量濃度為2.5、5、10、15、20、25 g/L，分別對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體7－m－2a進(jìn)行30 d的培養(yǎng).結(jié)果(表1)顯示，培養(yǎng)基中丙酸的質(zhì)量濃度對(duì)7－m－2a的生長(zhǎng)代謝有比較明顯的影響.在丙酸鈉質(zhì)量濃度小于10 g/L時(shí)，7－m－2a菌群的生長(zhǎng)代謝水平隨著丙酸鈉質(zhì)量濃度的升高而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在丙酸鈉質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)達(dá)到最高，其丙酸降解率和OD值分別為786 mg/(L·d)和1.6，乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為2 749 mg/L和249 mL/L.當(dāng)丙酸鈉質(zhì)量濃度增加到10 g/L以上的水平時(shí)，7－m－2a菌群的生長(zhǎng)代謝則呈現(xiàn)下降趨勢(shì).因此，對(duì)于菌群7－m－2a的培養(yǎng)，采用10 g/L的丙酸鈉質(zhì)量濃度是比較適宜的.

表1 丙酸質(zhì)量濃度對(duì)7－m－2a生長(zhǎng)代謝的影響

2.2 氮源對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

氮是細(xì)菌生長(zhǎng)代謝所必須的大量元素.對(duì)于特定的微生物，其對(duì)不同氮源的利用效率存在顯著差異.為尋求培養(yǎng)7－m－2a菌群的最佳氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別探討了氯化銨、酵母膏、胰蛋白胨、胰蛋白胨－酵母膏、胰蛋白胨－氯化銨、胰蛋白胨－酵母膏－氯化銨等單一氮源和復(fù)合氮源對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響，結(jié)果如表2所示.研究表明，以胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨調(diào)配成的混合氮源對(duì)7－m－2a菌群的生長(zhǎng)代謝最為有利，經(jīng)過(guò)30 d的培養(yǎng)，丙酸降解速率、菌群增殖量(OD600nm)、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別達(dá)到 870 mg/(L·d)、1.21、3 802 mg/L 和245 mL/L.而以酵母膏為唯一氮源時(shí)，7－m－2a的生長(zhǎng)代謝最不理想，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，其丙酸降解率、OD600nm、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為862 mg/(L·d)、0.83、3 504 mg/L 和 230 mL/L.

表2 氮源對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

2.3 Fe2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

許多氧化還原酶中都有鐵離子，它們作為酶的輔因子起著電子傳遞的功能.采用向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度 FeCl2的方式，探討了Fe2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響.

結(jié)果(表3)表明，F(xiàn)e2+對(duì)7－m－2a菌群的生長(zhǎng)代謝具有顯著影響.培養(yǎng)基中Fe2+質(zhì)量濃度在44～88 mg/L時(shí)，菌群7－m－2a的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸能力隨著Fe2+質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在Fe2+質(zhì)量濃度為88 mg/L時(shí)表現(xiàn)出最佳的生長(zhǎng)代謝能力，在此條件下經(jīng)30 d的培養(yǎng)，其丙酸降解速率、OD600nm、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別達(dá)1 019 mg/(L·d)、2.2、3 909 mg/L 和 266 mL/L.而當(dāng)培養(yǎng)基中的Fe2+質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，7－m－2a的生長(zhǎng)代謝則表現(xiàn)出了下降趨勢(shì)，說(shuō)明過(guò)量的Fe2+會(huì)對(duì)菌群的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用.分析認(rèn)為，F(xiàn)e2+促進(jìn)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的主要原因可能在于其參與了鐵氧還原蛋白的合成，而鐵氧還原蛋白是微生物產(chǎn)氫代謝的重要輔酶.Fe2+可以形成Fe－S原子簇為產(chǎn)氫反應(yīng)提供電子，并激活氫酶，F(xiàn)e2+的缺少可導(dǎo)致細(xì)菌甲酸裂解酶合成不足，進(jìn)而抑制了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝[13].

表3 Fe2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

2.4 Ca2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

如表4所示，培養(yǎng)基中Ca2+的有無(wú)對(duì)7－m－2a菌群的增殖影響并不顯著，但在添加1 g/L CaCl2的培養(yǎng)基中，7－m－2a菌群的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝能力明顯高于不含Ca2+的培養(yǎng)基.在含Ca2+培養(yǎng)基中經(jīng)30 d的培養(yǎng)，其乙酸生成量和產(chǎn)氫量分別為3 391 mg/L和259 mL/L，丙酸的平均降解速率為889 mg/(L·d);而在無(wú)Ca2+的培養(yǎng)基中，其乙酸生成量和產(chǎn)氫量分別為3 110 mg/L和243 mL/L，丙酸的平均降解速率為858 mg/(L·d).顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CaCl2在液體培養(yǎng)基中大多以結(jié)晶顆粒的形式存在，絕大多數(shù)菌體則聚集在這些顆粒表面，以游離狀態(tài)存在的菌體數(shù)量很少.對(duì)于這一現(xiàn)象需要給予辯證分析:培養(yǎng)基中添加適量的Ca2+，對(duì)于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體的培養(yǎng)是有利的，而要從中分離和純化產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌，Ca2+的添加則是一個(gè)不利因素.

表4 Ca2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

2.5 Mg2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

Mg2+是微生物生長(zhǎng)的必要物質(zhì)，是許多酶的激活劑，因而添加適量的Mg2+可能會(huì)對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌活性的提高具有重要作用[14].通過(guò)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同劑量的MgC12，考察了Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響.

結(jié)果(表5)表明，較低的Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)7－m－2a菌群的生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝具有刺激作用，而Mg2+質(zhì)量濃度較高時(shí)則表現(xiàn)為一定程度的限制作用.在13～63 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，7－m－2a菌群在 Mg2+質(zhì)量濃度為38 mg/L時(shí)表現(xiàn)出了較高的生長(zhǎng)和代謝活性，在培養(yǎng)30 d后，其丙酸降解速率、OD600nm、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為 908 mg/(L·d)、1.58、2 939 mg/L和 291 mL/L.

表5 Mg2+對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

2.6 泛酸對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

泛酸在微生物體內(nèi)主要以輔酶(CoA)的形式參與糖、脂類、蛋白質(zhì)的代謝，CoA有轉(zhuǎn)移?；闹匾饔?，泛酸缺乏時(shí)，過(guò)氧化物酶系的脂肪酸β－氧化就會(huì)受到抑制，從而進(jìn)一步影響到產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的生長(zhǎng)代謝.因而，在培養(yǎng)基中適量添加泛酸，將有助于提高產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的代謝活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表6)表明，低劑量的泛酸對(duì)7－m－2a菌群的生長(zhǎng)代謝具有刺激作用.在質(zhì)量濃度為10～50 mg/L的范圍內(nèi)，7－m－2a菌群在泛酸質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)代謝活性最高，經(jīng)過(guò)30 d的培養(yǎng)，其丙酸降解速率、OD、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為910 mg/(L·d)、1.99、3 779 mg/L和250 mL/L.而當(dāng)泛酸質(zhì)量濃度大于或小于30 mg/L時(shí)，7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝水平均有不同程度的降低.

表6 泛酸對(duì)7－m－2a菌群生長(zhǎng)代謝的影響

2.7 各項(xiàng)最優(yōu)指標(biāo)對(duì)7－m－2a菌群的綜合影響

根據(jù)2.1至2.6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體7－m－2a的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，即將其中的丙酸鈉、Fe2+和Mg2+的質(zhì)量濃度分別調(diào)整為10、88和38 mg/L，以胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨為混合氮源(分別為0.33 g/L)，同時(shí)添加30 mg/L的泛酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7.采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，在38℃下培養(yǎng)30 d，7－m－2a菌群對(duì)丙酸的降解速率為998 mg/(L·d)，乙酸生成量達(dá)3 947 mg/L，產(chǎn)氫量為295 mL/L，反應(yīng)混合液的OD600nm達(dá)2.96.與各單因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1～6)比較可見(jiàn)，在優(yōu)化條件下，7－m－2a菌群對(duì)丙酸的降解速率、乙酸生成量、產(chǎn)氫量以及菌體增殖量(OD600nm)要優(yōu)于丙酸質(zhì)量濃度、氮源、Mg2+和泛酸等單因子條件下的培養(yǎng)結(jié)果.以Fe2+為單影響因素的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中(表3)，獲得了1 019 mg/(L·d)的丙酸降解速率，這一結(jié)果高于優(yōu)化條件下的998 mg/(L·d)，但諸如乙酸生成量、氫氣生成量以及菌體增殖情況等均不如在優(yōu)化條件下的培養(yǎng)效果好.總體而言，經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基比較適宜7－m－2a菌群的生長(zhǎng)代謝.

3 結(jié)論

1)對(duì)于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體7－m－2a的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中適量添加 Fe2+、Mg2+、Ca2+和泛酸可有效提高菌群的代謝活性.優(yōu)化后培養(yǎng)基成分為，酵母膏 0.33 g，胰蛋白胨 0.33 g，微量元素液 10 mL，維生素液10 mL(添加泛酸 30 mg/L)，1 000 mL，pH 7.0，培養(yǎng)溫度采用38℃.

2)在優(yōu)化培養(yǎng)基中38℃培養(yǎng)30 d，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營(yíng)共培養(yǎng)體7－m－2a對(duì)丙酸的降解速率可達(dá) 998mg/(L·d)，乙酸生成量為3 947 mg/L，產(chǎn)氫量為295 mL/L，反應(yīng)混合液的OD600nm達(dá) 2.96.

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