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    甲硝唑栓微生物限度檢查方法學驗證

    2011-08-23 14:37:30王偉娜王濤
    醫(yī)藥導報 2011年11期
    關(guān)鍵詞:稀釋劑試液菌液

    王偉娜,王濤

    (1.黑龍江省食品藥品檢驗檢測所,哈爾濱150001;2.哈爾濱市第五醫(yī)院,150001)

    甲硝唑栓用于治療細菌性陰道炎和滴蟲性陰道炎,具有抗厭氧菌和抗滴蟲作用,是婦科常用藥物。為有效控制藥品質(zhì)量,保證微生物限度檢查方法的科學性和檢驗結(jié)果準確,筆者根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版[1]附錄微生物限度檢查的新要求,對甲硝唑栓進行了微生物限度檢查方法學驗證。

    1 材料

    1.1 培養(yǎng)基與試劑pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、無菌十四烷酸異丙酯。

    1.2 菌種金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]。

    1.3 樣品甲硝唑栓(黑龍江省富東制藥有限公司,批號:101005,規(guī)格:0.5 g)。

    1.4 儀器HTY-2000B型集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設備有限公司),薄膜過濾器(NS01-75D2,北京牛牛基因技術(shù)有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 菌液的制備取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮斜面培養(yǎng)物,接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,在30~35℃培養(yǎng)18~24 h;接種白念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,在23~28℃培養(yǎng)24 h。分別取上述培養(yǎng)液,用無菌0.9%氯化鈉溶液10倍依次稀釋至濃度為50~100 cfu·mL-1備用。取黑曲霉菌新鮮斜面培養(yǎng)物,加含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液[2]適量將孢子洗下,并用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋至濃度為50~100 cfu·mL-1,備用。

    2.2 供試液的制備取本品10 g,加至含無菌十四烷酸異丙酯20 mL和無菌玻璃珠的適宜容器內(nèi),置40~45℃保溫,充分振搖使溶解,加入45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL,萃取5~10 min,靜置,取水層作為1∶10的供試液。

    2.3 細菌、真菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

    2.3.1 試驗組取1∶10供試液10 mL,置無菌條件下500 r·min-1離心3 min,取上清液1 mL加適量稀釋劑,依薄膜過濾法過濾,沖洗量為800 mL,并在最后一次沖洗液中加入相應陽性細菌試驗菌1 mL,取出濾膜,菌面朝上,貼于營養(yǎng)瓊脂平板上,按規(guī)定條件培養(yǎng),測定細菌數(shù);取1∶10供試液1 mL,加適量稀釋劑,依薄膜過濾法過濾,沖洗量為800 mL,并在最后一次沖洗液中加入相應的真菌及酵母菌試驗菌1 mL,取出濾膜,菌面朝上,貼于玫瑰紅鈉瓊脂平板上,按規(guī)定條件培養(yǎng),測定真菌及酵母菌數(shù)(n=3)。

    2.3.2 菌液組吸取上述稀釋的陽性菌菌液各1 mL至平皿中,立即傾入相應的培養(yǎng)基,置規(guī)定條件培養(yǎng),測定各陽性菌的菌落數(shù)(n=3)。

    2.3.3 供試品對照組測定樣品本底的菌數(shù),方法同試驗組,不加陽性對照菌(n=3)。

    2.3.4 稀釋劑對照組取試驗用稀釋劑代替供試液測定,方法同試驗組(n=3)。

    2.3.5 回收率結(jié)果試驗組菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。稀釋劑對照組菌回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%。平均回收率結(jié)果見表1。

    表1 細菌、真菌及酵母菌方法驗證的平均回收率%

    從表1可以看出,5株試驗菌的試驗組菌回收率與稀釋劑對照組的菌回收率均>70%,因此,可采用該法測定樣品的細菌、真菌及酵母菌數(shù)。

    2.4 控制菌檢查方法的驗證

    2.4.1 試驗組取2份1∶10的供試液(每份10 mL),方法同“2.3.1”,沖洗液用量為600 mL,并在最后一次沖洗液中加入陽性對照菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌菌液各1 mL,取出濾膜,分別接種至膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基各100 mL中,搖勻,置30~35℃培養(yǎng)18~24 h;另取1∶10的供試液10 mL,加適量稀釋劑,依薄膜過濾法過濾,沖洗液為800 mL,并在最后一次沖洗液中加入陽性對照菌白念珠菌菌液1 mL,取出濾膜,接種至100 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,置23~28℃培養(yǎng)24~48 h。

    2.4.2 陰性對照組取等量稀釋劑,方法同試驗組(不加陽性對照菌液)。

    2.4.3 驗證結(jié)果試驗組檢出陽性試驗菌,陰性對照組無菌生長,見表2。

    表2 控制菌檢查方法學驗證結(jié)果

    從表2看出,該控制菌檢查方法適用于本品的檢查。

    3 討論

    甲硝唑栓具有較強的抑菌作用,因此,微生物限度檢查采用薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法進行測定,確保樣品的抑菌作用能夠有效去除。按照《中華人民共和國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查方法要求,將離心時間由5 min更改為3 min。

    甲硝唑栓為陰道用藥,《中華人民共和國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法規(guī)定,陰道、尿道給藥制劑增加對白念珠菌的檢查??刂凭鷻z查中取消陰性對照菌的檢查,以測定稀釋劑作為陰性對照,應無菌生長。

    [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:107-116.

    [2]李云龍.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:400.

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