草豆蔻總黃酮抗氧化活性研究

吳珍，陳永順，王啟斌

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院1.消化內(nèi)科;2.藥學(xué)部，湖北十堰442000)

草豆蔻主要化學(xué)成分為黃酮類和揮發(fā)油。草豆蔻總黃酮具有健胃、止吐、抑制血小板聚集和腫瘤形成、抗炎抑菌等藥理作用[1-3]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中研究草豆蔻總黃酮的體內(nèi)外抗氧化活性，并與茶多酚的抗氧化性能比較，以期為深入開發(fā)應(yīng)用該藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與儀器草豆蔻藥材(購(gòu)自湖北省十堰市宏康藥材公司，批號(hào):20100215，經(jīng)我院中藥房鑒定為姜科山姜屬植物草豆蔻種子)，二苯代苦味酰肼自由基(2，2 diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司)，茶多酚(湖北武漢浩河化工廠，純度≥98.8%，批號(hào):20090621)，番紅花紅(溫州市甌海精細(xì)化工公司，批號(hào):20090317)，維生素E(浙江新和成股份公司，批號(hào):20100106)，D-半乳糖(上海試劑廠，批號(hào):F20090108)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(上海超研生物科技有限公司，批號(hào):20090230)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(上海超研生物科技有限公司，批號(hào):20090407)。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2.0)g，湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCYY(鄂)2004-0012。

2 方法與結(jié)果

2.1 草豆蔻總黃酮的提取[4]精密稱取草豆蔻粉末200 g，過內(nèi)徑0.600 mm(30目)篩，用8倍量95%乙醇回流提取兩次，每次2 h，提取液減壓濃縮至含醇量約10%，抽濾，除去雜質(zhì)，加60%乙醇定容至100 mL，作為供試品溶液，備用。經(jīng)測(cè)定，總黃酮含量為6.82%。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2.3 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 DPPH法DPPH是一種較為穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm波長(zhǎng)處有吸收峰。測(cè)試時(shí)分別以50%乙醇將茶多酚、草豆蔻總黃酮提取液配制成相應(yīng)濃度。按文獻(xiàn)[5]方法測(cè)定，分別在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度樣品2 mL加DPPH 2 mL的吸光度(Ai)，不同濃度草豆蔻總黃酮樣品2 mL加50%乙醇2 mL的吸光度(Aj)，50%乙醇2 mL加DPPH2 mL的吸收光度(A0)。實(shí)驗(yàn)平行3次，草豆蔻總黃酮樣品及對(duì)照品分別測(cè)8個(gè)濃度，以50%乙醇作為空白。草豆蔻總黃酮樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力(SA)可采用以下公式計(jì)算:SA(%)=[1－(Ai－Aj)]/A0×100%。結(jié)果見圖1。

草豆蔻總黃酮與茶多酚對(duì)DPPH自由基都表現(xiàn)出明顯的清除活性，清除作用隨濃度的增加而增強(qiáng)，茶多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于草豆蔻總黃酮，當(dāng)濃度達(dá)到10 mg·mL-1時(shí)，兩者對(duì)DPPH自由基的清除能力相近，最大清除率可達(dá)78%。

2.3.2 草豆蔻總黃酮清除羥自由基活性測(cè)定[6]采用Fe(Ⅱ)催化過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生羥自由基(Fenton反應(yīng))，該反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基可使番紅花紅褪色。針對(duì)這一特點(diǎn)來(lái)研究草豆蔻總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力。取0.15 mol·L-1pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，40 μg·L-1番紅花紅1.0 mL，0.945 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)-Fe(Ⅱ)(新鮮配制)1.0 mL，不同濃度的樣品溶液0.5 mL、3%H2O21.0 mL(新鮮配制)，混合后在37℃水浴中反應(yīng)30 min后在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(As)?？瞻捉M以純化水0.5 mL代替樣品測(cè)定吸光度(A0)，對(duì)照組以純化水1.5 mL代替H2O2和樣品測(cè)定吸光度(A)，用純化水3.5 mL代替番紅花紅、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、樣品，磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，調(diào)零。并按下式計(jì)算清除率:清除率(%)=(As－A0)/(A－A0)×100%，結(jié)果見圖2。

當(dāng)草豆蔻總黃酮的濃度≥0.8 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到最大，最大清除率為88.5%，而此時(shí)茶多酚的清除率為58.5%，表明同濃度時(shí)，草豆蔻總黃酮對(duì)羥自由基的清除活性強(qiáng)于茶多酚。

2.3.3 抑制脂質(zhì)過氧化活性測(cè)定取大豆卵磷脂溶液0.5 mL(大豆卵磷脂200 mg溶解于10 mmol·L-1pH7.4磷酸鹽30 mL，冰浴震蕩)，加入pH7.14磷酸鹽緩沖液1.0 mL，不同濃度的樣品溶液1 mL，2.5 mmol·L-1EDTA-Fe(Ⅱ)1.0 mL，混勻后于37℃水浴中反應(yīng)45 min，再加入28%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)2.0 mL，1%硫代巴比妥鈉(thiobar bituric acid，TBA)1.0 mL，混勻后置于100℃沸水浴中加熱10 min，冷卻后在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A樣)，用磷酸鹽緩沖液調(diào)零，空白管用磷酸鹽緩沖液代替樣品測(cè)吸光度(A0)。并按下式計(jì)算抑制率:抑制率(%)=(A0－A樣)/A0×100%。從圖3中可以看出，草豆蔻總黃酮與茶多酚對(duì)卵磷脂過氧化物的抑制作用相近，濃度≥1.0 mg·mL-1時(shí)，草豆蔻總黃酮的最大抑制率91.5%。

2.3.4 清除超氧陰離子自由基活性測(cè)定[7]取0.05 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH=8.2)4.5 mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入試樣1 mL和25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mmol·L-1鹽酸(HCl)1 mL終止反應(yīng)，于299 nm處測(cè)定吸光度(Ai)，每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理?？瞻讓?duì)照組以相同體積純化水代替樣品。清除率(%)=(A0－A樣)/A0×100%。結(jié)果見圖4，隨著濃度的增加，草豆蔻總黃酮與茶多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力也增強(qiáng)，當(dāng)兩者濃度≥1.0 mg·mL-1時(shí)，草豆蔻總黃酮的清除率為79.8%，茶多酚的清除率為80.8%，表明兩者對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相近。

2.4 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 造模與給藥將小鼠隨機(jī)分成6組，每組6只，分別為正常對(duì)照組，衰老模型組，維生素E組，草豆蔻總黃酮低、中、高劑量組。除正常對(duì)照組外，其余5組小鼠均按100 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖造模，正常對(duì)照組皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模同時(shí)給藥治療，維生素E組按0.05 g·kg-1·d-1灌胃給藥，草豆蔻總黃酮低、中、高劑量組分別按相當(dāng)于生藥材20，40，60 g·kg-1·d-1灌胃給藥，正常對(duì)照組和衰老模型組給予等體積純化水，連續(xù)42 d。

2.4.2 樣品的處理小鼠摘眼球取血，抗凝劑抗凝后2 500 r·min-1離心10 min(離心半徑175 mm)，取上清液冰箱冷藏備用;動(dòng)物處死后迅速取出肝組織塊，用冰0.9%氯化鈉溶液洗滌除去血液，濾紙拭干，分別稱取0.2～0.3 g加入0.9%氯化鈉溶液(0.9%氯化鈉溶液體積總量是組織塊質(zhì)量的9倍)，制成10%肝組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑175 mm)，取上清液，置冰箱內(nèi)冷藏備用。用時(shí)稀釋。

2.4.3 主要檢測(cè)指標(biāo)血漿SOD活力及肝勻漿中MDA含量均依據(jù)試劑盒所附方法、步驟進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算結(jié)果。草豆蔻總黃酮中、高劑量組血漿SOD活性明顯升高(P＜0.01)，肝臟MDA含量顯著降低(P＜0.01)，結(jié)果見表1。提示草豆蔻總黃酮在體內(nèi)具有較好的抗氧化活性。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中以常用的且具有較強(qiáng)抗氧化能力的茶多酚為對(duì)照，考察了草豆蔻總黃酮對(duì)羥自由基、脂質(zhì)過氧化物及超氧陰離子自由基的清除能力，結(jié)果提示草豆蔻總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且抗氧化作用隨濃度的增加逐漸增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)以SOD及MDA這兩個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)草豆蔻總黃酮體內(nèi)的抗氧化活性，結(jié)果表明其可顯著提高血漿SOD活性，同時(shí)降低肝臟中MDA含量，提示其體內(nèi)具有較好的抗氧化活性。

表1 6組小鼠血清SOD活性及肝臟MDA含量測(cè)定結(jié)果Tab.1Effects of the total flavonoids from Alpinia katsumadai Hayata and tea polyphenols on the serum levels of SOD activity and MDA content in liver homogenate of aging mice in 6 groups±s

表1 6組小鼠血清SOD活性及肝臟MDA含量測(cè)定結(jié)果Tab.1Effects of the total flavonoids from Alpinia katsumadai Hayata and tea polyphenols on the serum levels of SOD activity and MDA content in liver homogenate of aging mice in 6 groups±s

與衰老模型組比較，*1P＜0.01，*2P＜0.05Compared with aging model group，*1P＜0.01，*2P＜0.05

?

黃酮類化合物主要通過酚羥基與自由基進(jìn)行抽氫反應(yīng)生成穩(wěn)定的半醌自由基，從而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到抗氧化作用，且高效低毒[8]。本研究提示草豆蔻總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但其活性成分有待進(jìn)一步研究。

[1]金宏，趙文英，公衍玲.草豆蔻的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(3):354－356.

[2]李元圓，桂新，楊莉，等.草豆蔻藥材質(zhì)量控制方法研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35(16):2091－2094.

[3]畢培曦，江潤(rùn)祥，吳德鄰.姜科藥用植物的化學(xué)、藥理和經(jīng)濟(jì)用途-(五)草豆蔻[J].中藥材，1999，11(6):44－45.

[4]王秀芹，李教社，楊孝江，等.草豆蔻中山姜素和小豆蔻明提取工藝的優(yōu)選[J].中藥材，2005，28(4):338－339.

[5]CHANG W C，SEI C K，SOON S H，et al.Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison[J].Plant Science，2002，163(6):1161－1168.

[6]項(xiàng)明志，劉紅梅，貝玉祥，等.訶子多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30(2):46.

[7]單承鶯，任紅榮，何海玲，等.毛膠蕷多糖的體外抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(12):86－89.

[8]張東慶，吳守林，張麗表，等.植物黃酮在抑制亞硝化反應(yīng)中的應(yīng)用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(6):733－734.