結(jié)核分枝桿菌TB10.4抗原的分子生物學特性研究進展＊

歐 珍，陳 祥，孟 闖，焦新安

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）這種古老的慢性人獸共患病，4千多年前就已流行于全球，而且至今仍危脅著全球近1/3人口的健康［1］。自1921年誕生且是當前唯一可行的卡介苗（Bacillus Calmette－Guérin，BCG），是至今接種人數(shù)最多、使用范圍最廣的疫苗之一，但該疫苗的免疫保護效果并不理想，對成年人保護率在0%～80%之間波動，臨床主要采用的結(jié)核菌素皮試（tuberculin skin test，TST）檢測方法敏感性為60%～84%也不盡人意，因此發(fā)展可替代的新型TB疫苗和有效的診斷方法一直是一項世界范圍的課題。上世紀80年代起全球TB疫情日趨嚴竣，極大地推動了以疫苗或診斷為目標的TB特異性抗原尋找的基礎(chǔ)性研究，焦點主要集中在結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）分泌性蛋白及膜相關(guān)蛋白上，其中結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液中低分子量區(qū)段蛋白表現(xiàn)出不俗的免疫原性，引起了廣泛的關(guān)注，從而發(fā)起對培養(yǎng)濾液蛋白全面深入的研究，而后以ESAT－6蛋白為原形，分子量在100個氨基酸大小的蛋白群組成了ESAT－6家族免疫 原 性 島 （immunogenicity islands）［2］，ESAT－6家族成員因中心保守W－X－G序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的特征，也被納入廣泛存在于放線菌中的 WXG/100超家族。TB10.4蛋白是后續(xù)發(fā)現(xiàn)的ESAT－6家族成員，其突出的免疫性能優(yōu)于代表蛋白ESAT－6［3］。本文綜述TB10.4在遺傳特征、分泌途徑、免疫特性和疫苗應(yīng)用前景等方面的研究進展。

1 TB10.4蛋白遺傳學特性

23個ESAT－6家族成員以成對串聯(lián)的方式分布在結(jié)核分枝桿菌標準毒株H37Rv的11個基因簇上，由系列基因esx A－W編碼（http：//genolist.pasteur.fr/tuberculist）。TB10.4蛋白由esx H編碼，esx H保守存在于主要的結(jié)核分枝桿菌復合物中（如M.tuberculosisH37Rv；M.bovisMNC 27；BCG Danish 1331；BCG Tokyo；M.kansasii；M.marinum；M.intracellulare）［3］，也保留在只具有最精簡功能致病基因的麻風分枝桿菌上（Mycobacteriumleprae），并低表達于結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra中，體外培養(yǎng)時微量分泌而感染過程中上調(diào)表達［4］，提示了TB10.4是結(jié)核分枝桿菌致病途徑中必不可少的因子，但其在致病過程中的具體作用還需深入發(fā)現(xiàn)。TB10.4蛋白分泌缺少典型的信號肽序列，它的分泌依靠存在于厚壁G＋菌中新型的T7S（typeⅦsecretion system）轉(zhuǎn)運至胞外［5］，為典型的T7S/esx－3系統(tǒng)分泌esx H及其相鄰基因esx G編碼產(chǎn)物，它們側(cè)翼保守分布的PE和PPE家族蛋白、ATP依賴性操縱子、膜相關(guān)ATP酶、結(jié)核分枝桿菌生長素相關(guān)絲蛋白酶都參與到這個系統(tǒng)的分泌。esx－3系統(tǒng)能特異性介導結(jié)核分枝桿菌生長素攝取鐵元素，維持感染過程中活性，一旦esx－3缺失將導致無法攝入鐵元素，干擾結(jié)核分枝桿菌在吞噬細胞中的復制［6］；鋅攝取抑制子（zinc uptake repressor，Zur）和鐵依賴型轉(zhuǎn)錄抑制子（iron dependent transcriptional repressor，IdeR）可動態(tài)調(diào)節(jié)esx－3系 統(tǒng) 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平［7－8］，但M.smegrmatis的esx－3系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄僅受IdeR調(diào)控；此外，體外培養(yǎng)獲得的二價陽離子及處于酸、過氧化氫、NO、生物膜壓力條件下將影響esx－3系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄水平［9］，種種現(xiàn)象說明了esx－3分泌系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌生理活動中的重要作用，涉及致病過程的發(fā)展。近來研究推測esx H與esx G基因以共表達形成1∶1緊密結(jié)合的二聚體形式發(fā)揮生物學功效，它們構(gòu)成的復合物相對于其單個蛋白而言空間構(gòu)象更加穩(wěn)定，耐受化學物質(zhì)及蛋白酶的降解，尤其抵抗低的p H值環(huán)境能力更強（如在成熟的吞噬小體中），esx H/esxG聚合體可能涉及早期對抗巨噬細胞吞噬行為的系列事件［10］。

2 TB10.4蛋白的免疫原特性

自從Skjot等應(yīng)用單克隆抗體PV－2從M.tuberculosisλgt11基因組文庫中篩選出TB10.4以來［3］，對TB10.4蛋白免疫特性的研究不斷深入。作為結(jié)核分枝桿菌顯著的T細胞抗原，TB10.4能被約70%以上TB病人T細胞強烈識別，釋放高水平的IFN－γ，產(chǎn)生 水平 相 當 于 ESAT－6 家 族 的CFP10蛋白，甚至高于ESAT－6蛋白，且被T細胞識別的表位覆蓋了TB10.4蛋白全長，BCG免疫者也能識別TB10.4，但主要集中在其蛋白N端位點［3］。TB10.4表位已被相繼鑒定出來，Majlessi等首先鑒定出 H－2d限制的TB10.420－28特異CD8＋T細胞表位［11］；H－2d提呈的 TB10.477－88CD4＋T 細胞表位被 Hervas－stubbs等人發(fā)現(xiàn)［12］；針對這兩個表位的T細胞雜交瘤都已研備成功，Majlessi等制備的MHC－Ⅰ限制TB10.420－28T細胞雜交瘤與董慧等制備的 MHC－Ⅱ限制性 TB10.474－88T 細胞雜交瘤都為在體外研究結(jié)核分枝桿菌 MHC－Ⅰ/MHC－Ⅱ抗原遞呈途徑的細胞分子機理提供了強有力的工具［13］；TB10.43－11H－2b限制性 CD8＋T 細胞表位而后由Billeskov等鑒定出來［14］；近來 TB10.4 CD8＋T細胞表位被全面系統(tǒng)地鑒定（圖1），8類MHC－Ⅰ單體限制性的33個T細胞表位交錯排布于TB10.4上，尤其是在蛋白N端與C端混合著多種MHC－Ⅰ限制性肽段［15］，顯 示 出 了 TB10.4 可 被 多 樣 性MHC－Ⅰ分子廣泛提呈的高效率及發(fā)展成疫苗的巨大潛質(zhì)。

圖1 TB10.4氨基酸序列內(nèi)部MHC－1限制性多肽片段（參照文獻［15］繪制）HLA－A＊0101限制性肽段淺藍色標注，HLA－A＊0201限制性肽段深藍色標注，HLA－A＊0301限制性肽段紫色標注，HLA－A＊1101限制性肽段紅色標注，HLA－A＊2402限制性肽段黃色標注，HLA－A＊0702限制性肽段深綠色標注，HLA－A＊1501限制性肽段綠色標注

有研究認為感染過程中分泌的TB10.4與r TB10.4蛋白表現(xiàn)出不同的表位識別，推測可能與感染中TB10.4蛋白發(fā)揮作用時采取的組織形式有關(guān)［16］。結(jié)核分枝桿菌復合物中存在的 TB10.3、TB12.9與TB10.4蛋白序列同源性分別高達75%和84%，但它們內(nèi)部的抗原決定簇譜卻大相徑庭，這種多樣性、功能替代型抗原決定簇漂變對于結(jié)核分枝桿菌逃避宿主免疫識別極其重要，病毒、寄生蟲、腫瘤細胞也采用了此類相似的生存策略［17］。BCG免疫小鼠對TB10.4產(chǎn)生遺傳限制性Th1型應(yīng)答，BABL/c（H－2d）小 鼠 免 疫 應(yīng) 答 強 烈，而C57BL/6（H－2b）反應(yīng)較弱［12］。在防御結(jié)核分枝桿菌感染中，CD4＋T細胞起關(guān)鍵作用，現(xiàn)有一些間接證據(jù)也不斷強調(diào)了CD8＋T細胞保護性作用，但CD8＋T細胞在免疫防御體系中的明確位置，誘導機制和CD4＋/CD8＋T細胞是否構(gòu)建了優(yōu)化的抗感染體系及怎樣構(gòu)建都不甚清楚，選取結(jié)核分枝菌特異性T細胞表位研究其在感染過程中免疫應(yīng)答狀況有助于理解結(jié)核病原菌與宿主之間復雜的免疫關(guān)系，TB10.4上眾多的T細胞表位是理想的研究對象。Billeskov等研究結(jié)核分枝桿菌初始感染小鼠時，機體誘導產(chǎn)生 H－2bTB10.43－11特異性 CD8＋T細胞，并在整個感染期間維持著高比例的CD8＋T/10.43－11數(shù)量，聚集在感染處的CD8＋T/10.43－11表達CD44、TNF－α、IFN－γ，此外還上調(diào)表達涉及體內(nèi)強細胞毒性的Fas L和LAMP1/2（CD107A/B）活化分子［14］，提示了CD8＋T在抗感染中發(fā)揮著作用；Kamath等將CD8＋T/10.420－28表位載運到 H－2d提呈的四聚體上定性分析CD8＋T/10.420－28細胞的分布和功能，發(fā)現(xiàn)慢性感染TB的小鼠肺部存在20%－30%比例的TB10.420－28特異性CD8＋T細胞，在體內(nèi)發(fā)揮著CTL作用，并低表達CD62L和CD45RB，代表著具有效應(yīng)T細胞功能，抗生素冶療感染小鼠后，CD8＋T/10.420－28細胞消減同時分化成一群中心記憶性表型CD8＋T細胞，再次攻毒具有免疫記憶小鼠，檢測到大量分化的 CD8＋T/10.420－28，表明CD8＋T/10.420－28實際上發(fā)揮功能性記憶 T細胞效應(yīng)，從而為廣為爭議的慢性感染疾病是否產(chǎn)生記憶性免疫應(yīng)答提供了正面證據(jù)［18］；Hoang等對感染進程中CD4＋T/10.474－88與CD8＋T/10.43－11動態(tài)免疫應(yīng)答情況研究結(jié)果顯示：CD4＋T/10.474－88是感染早期主導 T細胞，CD8＋T/10.43－11在感染后期達到高峰值，早期感染階段 CD4＋T/10.474－88和 CD8＋T/10.43－11在體內(nèi)都發(fā)揮細胞毒性功能，但 CD4＋T/10.474－88細胞毒性作用隨著感染進程逐漸減弱，而CD8＋T/10.43－11細胞毒性能力不斷增強，感染早期兩種類型T細胞中20%－25%比率的細胞表現(xiàn)為釋放IL－2、IFN－γ、TNF－α的多功能 T細胞，且絕大多數(shù)CD4＋T/10.474－88在感染期間保持這種多功能 T細胞效應(yīng)，CD8＋T/10.43－11最終無一例外地分化成為釋放IFN－γ、TNF－α細胞因子的終末效應(yīng) T細胞［19］。

3 TB10.4蛋白作為疫苗抗原的應(yīng)用前景

有效的TB疫苗能激發(fā)機體產(chǎn)生多功能的結(jié)核分枝桿菌特異性CD4＋和CD8＋T細胞協(xié)調(diào)的長效免疫記憶應(yīng)答。TB10.4蛋白在TB動物模型上誘導產(chǎn)生強烈的保護性Th1型免疫反應(yīng)，釋放對TB起關(guān)鍵保護作用的IFN－γ，越來越多關(guān)注在將TB10.4蛋白作為候選疫苗抗原的應(yīng)用上。Hervas－stubbs等將TB10.4作為亞單位疫苗與靶向T細胞的新型佐劑系統(tǒng)（DDA＋MPL＋TDM）混合使用能對攻毒小鼠產(chǎn)生極佳的保護效果，證實了TB10.4蛋白潛在的疫苗價值［12］。Ag85B－ESAT6（Hybrid 1）也是一種高效的TB疫苗，在小鼠、豚鼠、非人類靈長動物TB模型中均發(fā)揮著良好的保護作用［20］，但其中的ESAT6已更多的作為極具價值的診斷試劑廣泛地應(yīng)用于一些商業(yè)診斷方法中，如美 國 FDA 批準 的 QuntiFERON TB－2G test（Cellestis Ltd，Carnegie.VIC.Australia）和 TSPOT.TB test（Oxford.Immunotec.OXON.UK）。尋找能取代ESAT6的優(yōu)質(zhì)疫苗抗原顯得尤為重要，Dietrich等發(fā)現(xiàn)TB10.4替換ESAT6形成Ag85B－TB10.4融合物對小鼠的保護力可與 Hybrid 1和 BCG 相比［21］；目前 Ag85B－TB10.4（Hyvac4/AERAS－404）這株用于BCG加強免疫的候選亞單位疫苗正處于Ⅰ期臨床試驗中（Stop TB Partnership Working Group on New TB Vaccines，2009）。易感TB的HIV人群因CD4＋T細胞缺陷也亟需針對CD8＋T為靶向的保護疫苗，一些新型疫苗設(shè)計采用了以CD8＋T細胞為導向的策略，復制缺陷型腺病毒（r Ad）作為有價值的胞內(nèi)抗原運送系統(tǒng)能有效地傳遞外源基因表達產(chǎn)物進入CD8＋T細胞途徑。Radosevic等采用世界范圍內(nèi)低免疫存在的血清型35缺陷型腺病毒（r Ad35），將TB10.4蛋白與結(jié)核分枝菌另外兩顯性免疫原Ag85A和Ag85B重組入r Ad35構(gòu)建的基因工程苗（r Ad35－TBS）在小鼠 TB模型上效果顯著［22］，接著 Magalhaes等測試了使用表達perfringolysin的r BCG（AFRO－1）進行首免，r Ad35－TBS兩次加強免疫的程序，結(jié)果表明能有效的保護恒河猴免受結(jié)核分枝桿菌的感染，并介導釋放IFN－γ、TNF－α、IL－2多功能保護性 T細胞的產(chǎn)生［23］，這株r Ad35－TBS（Crucell Ad35/AERAS－402）候選疫苗正處于臨床Ⅱ期試驗當中（Stop TB Partnership Working Group on New TB Vaccines，2009），成年人臨床報告也顯示了AERAS－402能強勢誘導產(chǎn)生多功能保護性CD4＋T 細胞及持續(xù)發(fā)揮釋放IFN－γ、TNF－α的CD8＋T細胞保護作用，是株極具有前途的TB候選疫苗［24］。

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