脊髓損傷的研究進展

王俊娟 許華燕 黃 波 綜述 李赫東 審校

1（四川大學 華西基礎(chǔ)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學專業(yè)2007級本科，成都610041）

2（四川大學 華西婦產(chǎn)兒童醫(yī)院發(fā)育及干細胞研究所，成都610041）

脊髓損傷是交通、工礦事故及運動意外中的常見疾病，是一種嚴重危害人類健康的疾病?；颊咴趽p傷平面以下存在感覺、運動、反射及尿便功能障礙。隨著社會的發(fā)展，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）病例在臨床工作中日益增多，而目前臨床采用對癥的藥物和外科手術(shù)治療均未取得良好的效果。脊髓損傷后的修復主要面臨兩大問題：（1）如何用存活的、并具有生長潛能的神經(jīng)元替代已損傷的神經(jīng)細胞。（2）如何提供一個良好的微環(huán)境，以促神經(jīng)纖維生長、延伸、連接及功能重建［1］。目前實驗室的研究主要包括了細胞的移植修復；神經(jīng)營養(yǎng)因子的應(yīng)用；基因治療等幾個方面。本文將對SCI的修復進展方面進行綜述。

1 單一移植治療脊髓損傷

細胞移植意在通過移植的細胞替代丟失或損傷細胞（主要是神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞），并且分泌外源性細胞因子，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的局部微環(huán)境，為病變或殘留組織提供營養(yǎng)支持，促進神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建。

1.1 周圍神經(jīng)

1980年，Richardson，Aguayo等［2］將小鼠的自體周圍神經(jīng)植入SCI小鼠，使中樞神經(jīng)元受損的軸突定向生長，發(fā)揮其再生潛能。然而在后來的試驗中，這種方法只有在一位慢性的，不完全脊髓損傷患者上取得了輕微的效果，因為沒有對照，沒有病變處的細胞學證明，目前此法的有效性仍然值得商榷。

1.2 胚胎干細胞

胚胎干細胞是胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖細胞經(jīng)體外抑制培養(yǎng)而篩選出的細胞，具有發(fā)育全能性。Cummings［3］和Iwanami［4］分別在免疫抑制的小鼠和靈長目動物身上發(fā)現(xiàn)移植的胚胎干細胞（ESC）多可在脊髓損傷處存活，分化為少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，并且分泌營養(yǎng)因子促進宿主神經(jīng)元的再生［5］。Brustle等證實了ESC在脊髓損傷處可幫助軸突穿越損毀區(qū)，實現(xiàn)軸突的連續(xù)性，從而恢復其感覺和運動功能。然而，ESC因其分化的不可控，容易在移植處形成畸胎瘤，所以目前學者往往先將其在移植前誘導分化成特定的神經(jīng)元細胞系和膠質(zhì)細胞系［6］。盡管如此，目前ESC分化的不可控以及來源的倫理學爭議仍是其使用受限制的主要因素。

1.3 成體干細胞

相對ESC，成體干細胞可以來自于自體，無倫理學爭議，較為安全、無免疫排斥而被廣為研究，目前運用較多的成體干細胞主要是嗅鞘細胞、雪旺細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞以及神經(jīng)干細胞。

1.3.1 神經(jīng)干細胞因終身具有自我跟新、遷移和分化成各種類型的成熟神經(jīng)系統(tǒng)細胞（神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞）的能力，而被作為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復或正常凋亡神經(jīng)細胞更新的儲備力量。大量的研究認為一方面移植的神經(jīng)干細胞分泌的外源性細胞因子可以改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的局部微環(huán)境，為病變或殘留組織提供營養(yǎng)支持，促進神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建；另一方面神經(jīng)干細胞可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分化為成熟神經(jīng)系統(tǒng)細胞并良好地整合、補充或替代損失的神經(jīng)細胞，使脫髓鞘軸突重新髓鞘化，修復已缺失的神經(jīng)組織和功能性神經(jīng)單位，重建最適的神經(jīng)環(huán)路以及完整的脊柱運動單位［7］。

1.3.2 目前關(guān)于骨髓的間充質(zhì)干細胞移植治療脊髓損傷的研究結(jié)果也令人鼓舞，Kopen等［8］發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞移植后向病變部位組織滲透融合，可少量表達神經(jīng)細胞表型，形成的神經(jīng)元可以和損傷脊髓形成廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)系和功能性的突觸連接，分化的星形膠質(zhì)細胞可以參與血腦屏障的建立、少突膠質(zhì)細胞使脫髓鞘軸突重新髓鞘化，同時分泌營養(yǎng)因子，或形成內(nèi)皮細胞，幫助損傷的血管修復。

1.3.3 嗅鞘和雪旺細胞：在Li等將嗅鞘細胞移植入損傷兩個月以內(nèi)的SCI小鼠，觀察到小鼠損傷的神經(jīng)軸突周圍形成髓鞘，且部分功能恢復。Ramon－Cueto等［9］證實嗅鞘細胞能夠促進橫斷的脊髓運動神經(jīng)軸突延伸，穿越膠質(zhì)癱痕，定位于正確的脊髓層面。在Kleitman等［10］開展的雪旺細胞移植治療脊髓損傷的研究中，也分別觀察到了雪旺細胞很好的整合、膠質(zhì)癱痕的改善、軸突生長延伸人雪旺細胞形成的細胞隧道等現(xiàn)象。

2 聯(lián)合移植治療脊髓損傷

脊髓損傷后神經(jīng)細胞的再生障礙主要是軸突脫髓鞘和神經(jīng)元的壞死造成。因此用細胞替代和促進白質(zhì)再生對于SCI損傷后修復有著必要的作用。而一直以來研究的單一干細胞移植在實驗動物體內(nèi)的存活率低，定向分化成神經(jīng)細胞的能力不強。為解決這些問題，使干細胞能較多的并且定向分化為SCI后所需要的神經(jīng)細胞，填補脊髓損傷造成的空洞和囊性壞死，便衍生出聯(lián)合移植。目前聯(lián)合移植有多種干細胞共同移植和干細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合移植、干細胞和藥物的共同移植。

2.1 多種干細胞共同移植

現(xiàn)研究的干細胞聯(lián)合移植，涉及到神經(jīng)干細胞、臍血干細胞、嗅神經(jīng)鞘細胞、胚胎干細胞等多種干細胞。它們之間的聯(lián)合移植取得了一定的實驗成效。Salehi等［11］將嗅神經(jīng)鞘細胞（OEC）和胚胎干細胞源性運動神經(jīng)元（ESMN）單一移植和聯(lián)合移植入脊髓損傷模型中。通過組織學分析，發(fā)現(xiàn)OEC＋ESMN組中的組織增生及髓鞘化比單一移植和對照組明顯，并且有統(tǒng)計學意義。且在OEC＋ESMN組中ESMN的數(shù)量明顯高于單一的ESMN移植組，聯(lián)合移植組大鼠的下肢功能得到明顯的恢復，由此可以得出ESMN和OEC的聯(lián)合移植對于SCI的修復有協(xié)同作用，促進了神經(jīng)再生，部分恢復肢體功能。Niapour等［12］通過將人胚胎干細胞源性神經(jīng)前體細胞和施旺細胞聯(lián)合移植入脊髓損傷模型中，通過免疫組化等實驗分析，得出兩者的聯(lián)合移植能引發(fā)比單一移植更為明顯的神經(jīng)再生和功能恢復。Meng等［13］將b FGF基因修飾的羊膜上皮細胞（AECS）和神經(jīng)干細胞聯(lián)合移植，AECs／p LEGFP－h(huán)b FGF增加了神經(jīng)干細胞的存活率及定向分化為神經(jīng)元的功能，并且提供了神經(jīng)細胞的生長、分化所需的微環(huán)境。AECS可以作為神經(jīng)干細胞分化所需神經(jīng)營養(yǎng)因子的持續(xù)來源，因此此實驗表明聯(lián)合移植AECS和NSCS對SCI修復有重要作用。

神經(jīng)干細胞成瘤性小，而且能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，與其它細胞聯(lián)合移植表現(xiàn)出良好的輔助作用［14］。PARR等［15］將神經(jīng)干細胞移植到已移植骨髓間充質(zhì)干細胞的受損脊髓中，發(fā)現(xiàn)前者在有后者的幫助下較之單獨移植使空腔面積縮小程度更大。因骨髓間充質(zhì)細胞分泌的營養(yǎng)性生長因子可促進神經(jīng)干細胞的生長，且骨髓間充質(zhì)干細胞對于微環(huán)境的改善和神經(jīng)保護作用，可很大程度上提高神經(jīng)干細胞的存活率及增強其分化能力［16，17］。Li等［18］聯(lián)合移植雪旺細胞和神經(jīng)干細胞發(fā)現(xiàn)雪旺細胞能夠促進神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞分化及其軸突生長，重建神經(jīng)環(huán)路，損傷區(qū)域附近有大量移植細胞存活，并向周圍遷移，可明顯改善運動功能，在脊髓損傷的修復中發(fā)揮更好的作用。

2.2 干細胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合移植

NT－3和BDNF是神經(jīng)細胞生長微環(huán)境中的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，它通過與Trk等受體作用幫助現(xiàn)有的神經(jīng)元存活和分化，并對新的神經(jīng)元和軸突的生長和分化有重要作用。Yan等［19］聯(lián)合移植NT－3與臍血源性施旺樣細胞，結(jié)果顯示聯(lián)合移植組的行為功能恢復較單一移植好。.Deng等將BDNF與骨髓間充質(zhì)細胞（BMSCs）聯(lián)合移植入新西蘭兔損傷脊髓中，通過行為學、組織學和分子水平分析，結(jié)果示在移植后第3周到第5周BMSCs開始分化成神經(jīng)元樣細胞，實驗動物的神經(jīng)功能和病理破壞得到了較單一移植組明顯的改變，并有統(tǒng)計學意義。說明外源性的BDNF補充了脊髓損傷處的內(nèi)環(huán)境，有利于BMSCs的存活、分化為神經(jīng)元樣細胞以及促進BMSCs自身分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和炎癥介質(zhì)，如BDNFs和IL－6有利于脊髓損傷的恢復［20］。

2.3 干細胞和藥物的共同移植

López－Vales R等［21］將嗅神經(jīng)鞘細胞（OEC）和FK506進行聯(lián)合移植，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合移植組與單一移植及未移植組相比，聯(lián)合移植組下肢運動功能恢復及星型膠質(zhì)形成降低的大鼠數(shù)量較多。但是功能恢復及組織學分析結(jié)果聯(lián)合移植和單一移植并沒有太大差異。

聯(lián)合移植治療脊髓損傷，目前還處于實驗室研究階段，獲得的實驗數(shù)據(jù)不多，選擇何種成分聯(lián)合移植、移植的最佳時機和最佳方式，如何提高細胞的定向分化，如何成功獲得移植的細胞等都存在諸多疑慮。但聯(lián)合移植作為一項新興的實驗技術(shù)，在脊髓損傷治療中將會有很大的發(fā)展前景。

3 基因治療目前主要從四個方面進行

（1）將某種蛋白或神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因轉(zhuǎn)染給移植入的干細胞，使其在脊髓損傷處特異性的表達，幫助損傷脊髓修復。例如有學者曾將ESC進行修飾后，特異性的表達粘附分子LI。相比對照組，修飾后的ESC更好的在損傷處有序的生長，在損傷區(qū)附近與宿主細胞形成良好的神經(jīng)回路［22］。

（2）通過基因修飾，使得干細胞特異性的往少突膠質(zhì)細胞或者神經(jīng)干細胞分化，從而提供更多的功能細胞，實現(xiàn)細胞替代和髓鞘再生［23］。Dong等在體外培養(yǎng)中將Olig2，這個在少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育中起著重要作用的基因，轉(zhuǎn)導至NSC，使其激活了大量的NKX2.2，且使NSCs分化成了少突膠質(zhì)細胞系，將修飾后的細胞移植入SCI小鼠，發(fā)現(xiàn)損傷處空腔面積大大減少，白質(zhì)再生顯著增加，實驗組的小鼠運動功能較對照組明顯改善。

（3）通過宿主基因敲除的方式，控制宿主脊髓損傷后炎癥反應(yīng)，以及膠質(zhì)瘢痕的形成。Dicer酶是RNaseⅢ家族中特異識別雙鏈RNA的一員，是Micro－RNA形成所不可或缺的因素。而研究證明，Micro－RNA是一種內(nèi)源性的單鏈RNA.參與生物的基因表達調(diào)控，也被證實在脊髓損傷的過程中參與了炎癥反應(yīng)，氧化物以及膠質(zhì)瘢痕的形成，現(xiàn)有學者試圖通過將小鼠的Dicer基因敲除從而減少脊髓損傷后的膠質(zhì)瘢痕和炎癥反應(yīng)。

（4）宿主干細胞的定向誘導。如果能宿主自身干細胞通過基因誘導，定向分化成神經(jīng)干細胞和少突膠質(zhì)細胞，將可以很好的避免自身免疫排斥和干細胞來源的倫理學問題。目前，相關(guān)的數(shù)據(jù)比較少，但仍是研究的一個重要方向。

4 脊髓損傷的分子治療

分子治療主要是用特定的外源性抗體或阻斷劑抑制造成脊髓損傷各種因素發(fā)生，從而減少脊髓二次損傷，從分子層面增強脊髓軸突和神經(jīng)元生長來治療脊髓損傷，恢復脊髓功能。

（1）保護宿主神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，抑制膠質(zhì)瘢痕形成。甲基強龍松和姜黃素作為抗炎、抗氧化常用的藥物可以增高SOD水平和降低MDA水平從而達到抗氧化作用，氧化反應(yīng)是脊髓損傷中二次損傷的重要機制，降低氧化應(yīng)激可以保護宿主神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞［25］。同時把甲基強龍松和姜黃素聯(lián)合運用于SCI大鼠中，也得到顯著的效果［24，25］。UDCA 能夠穩(wěn)定線粒體膜，抑制細胞色素C的釋放，從而抑制caspase－3和caspase－7引起的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞凋亡。CSPG能抑制膠質(zhì)瘢痕形成，其消化產(chǎn)物軟骨素ABC（Ch ABC）能促進損傷點以外的軸突再生從而促進脊髓功能恢復［26］。

（2）阻斷抑制軸突脫髓鞘和生長的分子及通道，找出促進軸突發(fā)芽和神經(jīng)元再生的分子物質(zhì)。近年來研究較多的如BDNF，NT－31可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性的c AMP阻斷髓磷脂－MAG；C3－ADP－核糖轉(zhuǎn)移酶可以影響GTPases的Rho通路，這兩類物質(zhì)均通過阻斷抑制脊髓再生的信號，促進神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生，一定程度上恢復半橫斷損傷的實驗鼠的功能［27］。另外，抗RGMa抗體和NEP1－40也分別被證實可以抑制脊髓損傷部位的RGMa上調(diào)阻止RGMa激活Rho A－Rho激酶通路和阻斷Nogo的作用促進神經(jīng)軸突的生長［28，29］。Guest等［30］通過實驗發(fā)現(xiàn)鈉離子通道阻斷劑利魯唑，鉀通道阻斷劑4－氨基比林，亦能促進軸突生長。

SCI是一個多種分子，多種細胞共同參與的復雜的過程。目前實驗室對脊髓損傷的研究進展比較多，但在臨床上取得功能恢復的依舊比較有限。損傷的具體的機制到底如何，哪種治療方式最具治療效果，將現(xiàn)有的研究應(yīng)用于臨床時是否具有絕對的安全性等一系列問題需要我們投入更多的研究。目前的基因治療運用先進基因工程技術(shù)，轉(zhuǎn)染有用的基因片段到損傷的脊髓內(nèi)，分子治療靶向抑制引起脊髓損傷的各種因素，細胞移植為損傷提供替代細胞和營養(yǎng)因子，因此我們相信未來的時間內(nèi)，多種治療方式的聯(lián)合應(yīng)用將成為脊髓損傷修復的熱點研究，也將會為臨床的脊髓損傷患者提供一條有效的治療途徑。

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