抗雞球蟲病藥物及其耐藥性現(xiàn)狀

李佩國，李蘊玉，賈青輝，張艷英，張香齋，張文香

(河北科技師范學院動物科技學院，河北 秦皇島，066600)

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳屬球蟲寄生于雞的腸道不同部位所引起的以腹瀉、血便、生長遲緩、飼料轉化率降低、死亡為特征的寄生蟲性疾病，每年全世界因該病造成的損失高達80億美元［1］。因球蟲在雞體內發(fā)育的復雜性和特殊性，使得球蟲的免疫性較其他生物的免疫性更為復雜，在養(yǎng)雞生產中球蟲疫苗因其穩(wěn)定性差、弱毒返強等原因而受到限制，因此防治雞球蟲病仍以化學藥物為主。但因抗球蟲藥物的長期使用，不可避免地導致耐藥蟲株的產生。迄今為止，幾乎所有的抗球蟲藥均有耐藥蟲株的出現(xiàn)，且表現(xiàn)出對與該藥同類或作用機理相同的其他藥物產生一定程度的交叉耐藥性［2，3］。由于地域的差別，用藥習慣的不同，各地的耐藥譜也不盡相同。因此，在制定抗球蟲方案時，很重要的一點就是要了解目前可用的抗球蟲藥對養(yǎng)雞場的艾美耳球蟲的野毒株的藥效。由于球蟲耐藥性普遍存在且危害巨大，為此，各國的科學家，尤其是美國、英國等科學家對耐藥性的機理進行了大量的調查研究，但至今均未能闡明雞球蟲耐藥性是如何產生和發(fā)展的。

1 抗雞球蟲病藥物種類

自Levine［4］發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物對雞球蟲病有療效，Grumbles［5］首先用磺胺喹噁啉預防雞球蟲病以來，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)呋喃類、生物堿類、離子載體類等藥物用來防治球蟲病。迄今防治雞球蟲病的藥物已達50多種，但有些藥物因毒性太高或療效不佳而被淘汰。目前仍應用生產的抗球蟲藥有20余種，按其化學結構和生產過程大致可分為聚醚離子載體類和化學合成類抗球蟲藥。

1．1 聚醚離子載體類抗球蟲藥

1．1．1 莫能霉素 別名瘤胃素、莫能菌酸、欲可胖，是肉桂地鏈霉毒菌的發(fā)酵產物，也是第1個被用于抗球蟲作用的離子載體藥物，推薦劑量為100～121 mg/kg，1971年開始投放市場，在20世紀80年代，曾一度達到80%的市場占有率［6］。莫能霉素與泰妙霉素、竹桃霉素存在配伍禁忌;高劑量使用可引起肉仔雞生長嚴重受抑，甚至中毒死亡;產蛋雞禁用。

1．1．2 鹽霉素 又稱沙利霉素，商品名為優(yōu)素精、賽可喜，是日本科研制藥株式會社的研究者在1978年于白色鏈霉菌的培養(yǎng)物中首先發(fā)現(xiàn)的聚醚類抗生物質，推薦劑量為40～60 mg/kg。它是我國最早引進的離子類載體類抗球蟲藥，對堆型艾美耳球蟲效果較好，對柔嫩、巨型和布氏艾美耳球蟲效果較弱，具有明顯的促生長效果，價格低廉。因該藥能使蛋殼質量和產蛋量下降，故不宜應用于產蛋雞。

1．1．3 那拉霉素 又稱甲基鹽霉素，推薦劑量為54～72 mg/kg，1985年上市。其化學特性和離子載體活性與鹽霉素非常相似，與鹽霉素和莫能霉素的功效相近，與尼卡巴嗪聯(lián)合使用，可降低尼卡巴嗪的毒性。

1．1．4 馬杜霉素 又名加福、杜球、克球皇、抗球王，是美國氰胺公司從馬杜拉放線菌的培養(yǎng)液中提取的一種聚醚抗生素，推薦劑量為5～6 mg/kg，1984年在巴西上市，1989年在美國注冊使用，后又在拉美和歐共體各國相繼出現(xiàn)，是目前我國市場占有率最高的離子載體類抗球蟲藥。但安全范圍窄，劑量超過6 mg/kg或長期使用會抑制生長，使用不當容易引起中毒。

1．1．5 拉沙里霉素 又名球安，是由拉沙里鏈霉菌培養(yǎng)物中分離得到的唯一的一種雙價離子載體類抗球蟲藥，推薦劑量為75～125 mg/kg，1974年上市，對柔嫩艾美耳球蟲效果較好。但產蛋雞禁用，雞服該藥后要大量飲水，易使糞便變稀，使其應用受到限制。

1．1．6 海南霉素 是中國醫(yī)科院上海藥物研究所的科技人員從海南島土壤中的稠李鏈霉菌東方變種的培養(yǎng)物中獲得的第1個具有知識產權的原創(chuàng)性防治雞球蟲病專用藥物，也是迄今為止我國唯一批準上市的屬一類新獸藥的抗球蟲藥，1994年正式列入我國的飼料添加劑允許使用的品種目錄。試驗證明該藥是一種高效抗球蟲藥物，其預防效果明顯優(yōu)于治療效果［7］，且對某些離子載體類抗生素已產生耐藥的蟲株也有較高療效，還能提高飼料的轉化率和促進生長發(fā)育。

各種離子載體類抗球蟲藥的作用機理是相似的，即通過結合Na+，K+，Ca2+或Mg2+等陽離子形成脂溶性復合物后進入子孢子或裂殖子內，細胞內陽離子大量堆積，破壞正常滲透壓，最終導致蟲體破裂致死。它們主要作用于侵入期蟲體(子孢子，第1代第2代裂殖子)，不僅抗球蟲譜廣，且耐藥性產生慢等特點，成為目前應用最廣泛的抗球蟲藥。

1．2 化學合成類抗球蟲藥

1．2．1 磺胺類 主要包括磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間二甲基嘧啶，是第1個被廣泛用于防治球蟲病的藥物。其作用機理是與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，阻止二氫葉酸合成，最終影響核蛋白質的合成，實現(xiàn)抑制球蟲的目的。因該藥主要影響球蟲的裂殖，因此，治療時須采用足夠的劑量和連續(xù)用藥才能有效，否則球蟲易產生耐藥性。但如能合理配伍，磺胺類不但能夠抑制球蟲耐藥性，而且對混合細菌感染也有療效。因磺胺類藥物的生產制造過程中對環(huán)境造成嚴重污染，日本等國家禁止生產此類藥物。

1．2．2 酰胺類 主要是球痢靈，即二硝托胺，是20世紀60年代上市的老藥，80年代開始在我國普遍使用，推薦劑量為125 mg/kg。球痢靈對球蟲的第2代裂殖體生殖有抑制作用，其作用的峰期是在感染后的第3 d，對卵囊孢子形成也有作用。該藥不會影響雞球蟲免疫力的產生，故適用于肉雞和蛋雞，并且有顯著地促進肉雞增重和提高飼料轉化率的作用。

1．2．3 吡啶類 主要是克球粉，即氯羥吡啶，是20世紀80年代中期在國內上市的化學合成抗球蟲藥，推薦劑量為125 mg/kg。對7種球蟲均有效，主要作用于子孢子，對球蟲的活性高峰期是子孢子期，即感染后第1 d，因此無治療價值。初期使用該藥時對球蟲有較好的效果，但能顯著抑制機體對球蟲產生免疫力，而且球蟲對該藥極易產生耐藥性。據報道，氯羥吡啶對小鼠的體細胞和生殖細胞有弱致突變作用。

1．2．4 胍類 主要是氯苯胍，是我國研制的第1個專用抗球蟲藥，20世紀80年代初已上市應用，推薦劑量為30～60 mg/kg。對球蟲裂殖體、配子體及卵囊有抑制作用。其作用機理是干擾蛋白質的形成，不影響雞對球蟲免疫力的產生，但最大的缺點是66 mg/kg劑量可引起雞蛋和肉品氨臭味，影響雞肉的品質。該藥上市早，有些地方已停用。

1．2．5 喹啉類 主要包括苯甲氧喹啉、癸氧喹啉和丁氧喹啉3種，苯甲氧喹啉的藥效比癸氧喹啉強2倍，比丁氧喹啉強10倍。該類藥作用機理為破壞球蟲線粒體內細胞色素體系的電子運輸，抑制球蟲的呼吸作用，使球蟲不能正常發(fā)育。此類藥品的用藥成本較高，極易產生耐藥性，應用價值有限。目前歐盟地區(qū)已開始禁用任何一種喹諾啉類抗球蟲藥。

1．2．6 抗硫胺素類 主要是氨丙啉，推薦劑量為100～125 mg/kg，其化學結構與硫胺素(VB1)相似，是硫胺的拮抗劑，其抗球蟲作用可能是競爭性地抑制蟲體硫胺攝取而導致硫胺缺乏，妨礙蟲體內的糖代謝過程，從而抑制了球蟲的發(fā)育。作用的高峰在球蟲生活史的第3 d，主要作用于第1代裂殖體，阻止形成裂殖子，對有性繁殖和子孢子也有一定的抑制作用。其特點是對雞各種球蟲均有效，尤其是對第1代裂殖體特別有效，可有效地控制球蟲病的發(fā)生。此外，該藥毒性小，安全范圍大，使用后不影響雞對球蟲產生免疫力。氨丙啉常與乙氧酰胺苯甲酯聯(lián)合使用，通過乙氧酰胺苯甲酯干擾球蟲葉酸合成途徑產生廣譜作用。

1．2．7 均苯脲類 僅尼卡巴嗪一種，是國際上最早研制成功的專用抗球蟲藥，推薦劑量為20～25 mg/kg。它主要對球蟲第2代無性周期的裂殖體(周期第4 d)有抑制作用，具有廣譜、高效和產生耐藥性慢等優(yōu)點，對其他抗球蟲藥耐藥的球蟲使用本品仍有效，在我國東南部的使用相當普遍。該藥的缺點是導致雞厭食，抑制雞的生長，炎熱的夏季可加重雞的熱應激反應而導致死亡，故在夏季應謹慎使用。但尼卡巴嗪有良好的配伍性，通過配伍可以克服其缺點［8］。

1．2．8 植物堿類 主要是常山酮，由法國Roussel-Uclaf公司開發(fā)生產，其商品名為速丹，它是從中草藥常山中提取出的常山堿的衍生物。常山酮對球蟲發(fā)育周期中的3個階段即子孢子、第1代裂殖體和第2代裂殖體都能發(fā)揮殺死作用，使早期病變不繼續(xù)發(fā)展，保持腸道正常吸收功能，是一種廣譜高效殺蟲藥，3 mg/kg常山酮即可殺死肉雞柔嫩、毒害、巨型、堆型、變位和波氏艾美耳球蟲，且停藥后無復發(fā)現(xiàn)象。常山酮主要優(yōu)點是毒副作用小，安全范圍大，在組織中代謝很快，并隨糞便排出體外，肉品和內臟中幾乎沒有藥物殘留。因化學結構獨特，與其他抗球蟲藥無交叉耐藥性。但國內目前尚無常山酮工業(yè)化報道，產品主要依靠進口，價格昂貴，使其應用受到了一定的限制。如果常山酮的成本能夠降低，應用前景廣闊［9］。

1．2．9 三嗪類 主要是地克珠利與妥曲珠利。地克株利屬三嗪苯乙腈化合物，該藥1986年由比利時楊森公司研制開發(fā)，目前已在美國、德國等40多個國家上市，我國于1997年獲準生產，現(xiàn)在已有多家工廠生產，推薦劑量為1 mg/kg。妥曲珠利是德國拜耳公司20世紀80年代開發(fā)的三嗪酮類抗球蟲藥物，國內稱為百球清。這類藥是化學合成藥中最優(yōu)秀的一類，具有廣譜、高效、低毒的特點，是目前用藥濃度最低的一類抗球蟲藥。地克珠利可能影響球蟲核酸的合成，它可允許裂殖體與小配子體核的正長生長與分裂，但卻阻止其進一步分化，使得裂殖生殖或配子生殖不能正常完成。其抗球蟲活性既可表現(xiàn)在無性生殖階段，也可表現(xiàn)在有性生殖階段。妥曲珠利可在球蟲正常發(fā)育階段誘導蟲體細胞內質網和高爾基體發(fā)生膨脹，從而使細胞核周圍空間的分布發(fā)生異常。同時，妥曲珠利還抑制球蟲呼吸鏈酶活性，抑制球蟲細胞線粒體內氧化磷酸化作用，結果導致球蟲的呼吸作用受阻，從而影響蟲體的正常新陳代謝，導致球蟲死亡。其缺點是半衰期短，需要連續(xù)用藥，但又易產生耐藥性。費陳忠等［10］在地克珠利結構的基礎上，合成并篩選出高效安全的新型三嗪類抗球蟲化合物—納川珠利，有望開發(fā)成為一種新的抗球蟲藥物。

2 抗球蟲藥耐藥性現(xiàn)狀分析

2．1 聚醚離子載體類抗球蟲藥的耐藥性

起初，人們認為球蟲對聚醚離子載體類藥物不會產生耐藥性，但此論斷很快即被否定。因國內外研究者紛紛從田間分離到了耐藥性蟲株，如Badrnik等［11］從田間分離出了對莫能菌素失去敏感性的柔嫩艾美耳球蟲。Urara等［12］報道，田間分離的大部分球蟲蟲株對馬杜霉素和鹽霉素有全部和部分的耐藥性。而國內的球蟲耐藥性則更為嚴重，不僅耐藥譜寬，且多重耐藥和交差耐藥明顯。如孔繁瑤等［13］用田間分離的15株柔嫩艾美耳球蟲進行實驗室檢測，結果表明80%的蟲株對莫能菌素失去了敏感性。汪明等［14］對從北京、天津、山東和廣東4省市10個雞場分離的10株柔嫩艾美耳球蟲進行了調查，結果發(fā)現(xiàn)30%蟲株對馬杜霉素有耐藥性，40%蟲株對拉沙里菌素有耐藥性，70%蟲株對鹽霉素有耐藥性。韓謙等［15，16］和劉群等［17］證實山東聊城、諸城及濰坊地區(qū)的雞混合球蟲對鹽霉素、拉沙里菌素、莫能霉素、馬杜霉素均存在不同程度的耐藥性。曾明華等［18］報道，柔嫩艾美耳球蟲合肥野外株對鹽霉素、莫能菌素和拉沙菌素的抗球蟲指數(ACI)全部低于160。對廣東省柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的調查表明，馬杜霉素耐藥比例為95．2%，而鹽霉素、拉沙霉素和森杜拉霉素的耐藥蟲株比例為100%［19］。黃兵等［20］對上海地區(qū)雞球蟲耐藥程度進行了調查，發(fā)現(xiàn)莫能菌素完全耐藥性的比例高達67%～80%，馬杜霉素中度耐藥和完全耐藥的比例達到50%。顧有方等［21］報道，柔嫩艾美耳球蟲南京株和宣城株對馬杜霉素已產生不同程度的耐藥性。徐金俊等［22］報道，柔嫩艾美耳球蟲揚州分離株對鹽霉素、馬杜霉素具有完全耐藥性。張香齋等［23］等報道，秦皇島株柔嫩艾美耳球蟲對馬杜霉素呈現(xiàn)輕度耐藥，而唐山株則表現(xiàn)完全耐藥。魏峰等［24］報道，長春市柔嫩艾美耳球蟲分離株對莫能菌素無耐藥性，對馬杜霉素有中度耐藥性，對鹽霉素有完全耐藥性。

一般認為該類藥物的作用機理相似，在球蟲對一種藥物產生耐藥性以后，也會對此類的其他藥物敏感性降低，即產生交叉耐藥性，但此類報道不一致。如1989年Raether試驗發(fā)現(xiàn)馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素、拉沙里菌素之間存在高度交叉耐藥性。而同年Bedrik試驗表明馬杜霉素能有效控制其他幾種離子載體抗生素藥物已產生耐藥性的蟲株，拉沙里菌素可以控制對莫能菌素和甲基鹽霉素已產生耐藥性的蟲株［11］。安健等［25］和王黎霞等［26］試驗證明馬杜霉素也能控制對莫能菌素和鹽霉素有耐藥性的蟲株，表明離子載體類間有不完全的交叉耐藥性。

2．2 化學合成類抗球蟲藥耐藥性現(xiàn)狀分析

化學藥物雖然多數療效較好，但有些也易產生耐藥性。早在1945年美國就從野外分離到了懷疑對磺胺類藥物具有耐藥性的蟲株，1954年又從雞場分離出對磺胺類藥物有耐藥性和無反應的蟲株。英國的Hemsley分離到耐氨丙啉的布氏艾美耳球蟲的蟲株和分別耐球痢靈和尼卡巴嗪的柔嫩艾美耳球蟲蟲株。法國的Hamet分離到了耐常山酮堆型、柔嫩艾美耳球蟲蟲株。在國內，彭新宇等［19］發(fā)現(xiàn)球凈對廣東省柔嫩艾美耳球蟲野外分離株的耐藥比例最低(13．6%)，其次為氯苯胍(75%)、地克珠利(82．2%)、球痢靈(88．8%)，對氯羥吡啶、氨丙啉的耐藥蟲株比例為100%。李佩國等［27］的調查表明，柔嫩艾美耳球蟲秦皇島株對力克球(有效成分:磺胺喹噁啉鈉)中度耐藥，對球敵(有效成分:地克珠利)輕度耐藥，而對氨丙啉則無耐藥性。2008年又進一步試驗表明，該蟲株對尼卡巴嗪和氨丙啉呈現(xiàn)輕度耐藥，對克球粉、瑞冠球和金三特呈現(xiàn)中度耐藥，對球敵呈現(xiàn)完全耐藥性［23］。徐金俊等［22］報道，柔嫩艾美耳球蟲揚州分離株對甲基三嗪酮敏感，對氨丙啉具有中等耐藥性，對球痢靈、氯羥吡啶、尼卡巴嗪、地克株利具有完全耐藥性。肖寒等［28］報道，安徽部分地區(qū)的7種艾美耳球蟲對地克珠利和托曲珠利具有重度耐藥性，對尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉鈉和磺胺氯吡嗪鈉具有中度耐藥性。柔嫩艾美耳球蟲長春分離株對妥曲珠利無耐藥性，對尼卡巴嗪有輕度耐藥性，對地克珠利有中度耐藥性，對氯羥吡啶和鹽霉素有完全耐藥性［24］。目前，國內也在實驗室分別誘導了抗氯嗪苯乙氰［29～31］、氯羥吡啶［29］和常山酮［30］等的耐藥株。

3 球蟲耐藥機理探討

由于球蟲耐藥性普遍存在且危害巨大，自20世紀50年代以來，各國的科學家，特別是英國、美國等科學家對球蟲耐藥性的機理進行了大量的調查研究，但至今都未能闡明雞球蟲耐藥性是如何產生和發(fā)展的。Chapman［32］認為球蟲耐藥性因原來就存在于球蟲群體中的突變個體多次重復選擇的結果。Chapman［33］用柔嫩艾美耳球蟲進行誘導試驗，繼代16次便產生了對莫能菌素有耐藥性的蟲株。Tamas［34］用(1～5)×10－6馬杜霉素做誘導實驗，經14代誘導出對5×10－6馬杜霉素有耐藥性的柔嫩艾美耳蟲株。在國內，安?。?5］也誘導分離出18次繼代后的馬杜霉素耐藥株。余麗蕓等［36］經過15次繼代，誘導產生了對135 μg/g拉沙里菌素的耐藥性蟲株。韓紅玉等［37］采用藥物濃度逐漸遞增的方法，以0．05×10－6地克珠利和2．0×10－6馬杜霉素為起始誘導濃度，分別經過18次和20次傳代，在實驗室誘導了柔嫩艾美耳球蟲對地克珠利和馬杜霉素的耐藥性蟲株。這種突變體的產生可能是因球蟲與藥物接觸后所致的適應性，也可能是由于其自身發(fā)生突變。Jeffers［38］曾設想球蟲耐藥性的產生是因蟲體基因發(fā)生的突變。安健等［39］采用RT-PCR方法，以柔嫩艾美耳球蟲總RNA反轉錄的cDNA為模板能夠鑒別出馬杜霉素耐藥蟲株和3株馬杜霉素敏感株，其鑒定結果與雞體試驗結果一致，說明敏感株和耐藥株在序列AGD5上的差異發(fā)生在轉錄水平。韓紅玉等［40］利用抑制消減雜交技術(SSH)，通過2輪雜交和2次PCR分別構建了富含兩個耐藥株與敏感株孢子化卵囊之間差異表達基因的消減cDNA文庫。經比較發(fā)現(xiàn)，有4個新的cDNA片段可能與地克珠利耐藥株的產生有關;有3個新的cDNA片段可能與馬杜霉素耐藥株的產生有關。2006年韓紅玉等［41］又采用銀染mRNA差異顯示技術(DD-PCR)，發(fā)現(xiàn)地克株利耐藥蟲株和馬杜霉素耐藥蟲株分離的差異片段中都有2個cDNA片段，經初步鑒定可能與柔嫩艾美耳球蟲的耐藥性有關。Zhu等［42，43］利用SDS-PAGE技術對柔嫩艾美耳球蟲敏感株WIS(0)和莫能菌素耐藥株WIS(1)，WIS(5)，WIS(25)之間蛋白質水平上進行了比較，結果表明耐莫能菌素株具有4個超表達的蛋白質，其條帶隨耐藥程度的增加而逐漸清晰，這些超表達的蛋白質可能與球蟲對莫能菌素產生了耐藥性有關。劉文江等［44］用2-DE法比較了柔嫩艾美耳球蟲敏感株、地克珠利耐藥株和馬杜霉素耐藥株第2代裂殖子蛋白質表達圖譜，通過分析發(fā)現(xiàn)了耐藥株和敏感株之間有一些表達差異的蛋白質斑點。相關研究證明耐藥性球蟲株已發(fā)生了蛋白質水平上的變化，而且蛋白質是基因表達的產物。生物體之所以能表現(xiàn)出各種各樣的特性，主要是由于其內部基因差異表達所致。因此，若能分離和鑒定出球蟲耐藥基因將有助于揭示雞球蟲病的發(fā)生機理。

4 結 論

多年來，抗球蟲藥物在雞球蟲病的防治中發(fā)揮了重要作用，但無論何種抗球蟲藥，在連續(xù)使用一個時期后，都不可避免地面臨著耐藥性問題。由于我國地域的差別，用藥習慣的不同，各地的耐藥譜也不盡相同。為指導養(yǎng)雞生產合理選擇抗球蟲藥物，提高抗球蟲效果，應加強球蟲耐藥性的檢測，及時掌握球蟲對常用抗球蟲藥的耐藥性動態(tài)，克服用藥的盲目性。同時，尚需對球蟲耐藥性機理進一步探討，以便為新藥的開發(fā)和基因工程疫苗的研究提供理論依據。

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