噬菌體展示肽庫技術(shù)及其在分子病原細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用

趙紅蕾,刁昱文,馮 新,高 宇,劉珊珊,顧敬敏,雷連成,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130062)

1 概 述

近年來,抗菌藥物耐藥性成為需要緊急采取行動的全球問題,迫切需要尋找能有效殺傷病原微生物,且不易形成耐藥性的新型抗微生物制劑或具有防御作用的新型疫苗?；谑删w展示技術(shù)的病原體抗原表位分析既是研究抗原分子的結(jié)構(gòu)和功能、抗原—抗體反應(yīng)機制的基礎(chǔ),又可為多肽疫苗研制、藥物篩選以及特異血清學(xué)診斷方法的建立提供重要的線索和依據(jù)[1]。

噬菌體表面展示技術(shù)是Smith于 1985年首先建立起來的一種新的生物技術(shù)[2],它將外源基因插入絲狀噬菌體基因組中,從而使表達(dá)的外源肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合而展示在噬菌體表面,被展示的蛋白或肽可以維持相對穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性[3,4]。1990年,Scott等[5]首次將隨機序列肽與絲狀噬菌體表面蛋白g融合展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機肽庫。之后,噬菌體肽庫技術(shù)訊速發(fā)展,已廣泛用于抗原表位篩選、免疫學(xué)診斷、疫苗研制、藥物篩選等方面,尤其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究[6]、抗原表位分析[7]、人工抗體制備[8]、激素或病毒受體結(jié)合序列及酶的底物或抑制劑序列的確定、細(xì)胞因子拮抗劑的研制和尋找細(xì)胞內(nèi)信號蛋白等研究中發(fā)揮重要作用[9]。筆者從噬菌體展示技術(shù)的基本原理、肽庫的構(gòu)建、噬菌體肽庫的分類、噬菌體肽庫的篩選方法等方面,綜述了噬菌體展示肽庫技術(shù);從抗原表位研究、免疫診斷研究、基因疫苗研究、抗菌藥物的靶向投遞等方面,闡述了噬菌體展示肽庫技術(shù)在分子病原細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用;并對今后的研究方向進(jìn)行了展望。

2 噬菌體展示肽庫技術(shù)

2.1 噬菌體展示技術(shù)的基本原理

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體衣殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置,在閱讀框正確且不影響其衣殼蛋白正常功能的情況下,使外源多肽或蛋白與衣殼蛋白融合表達(dá),融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后,洗去未結(jié)合的游離噬菌體及親和力較弱的噬菌體,然后以競爭性受體或酸性洗脫劑洗脫與靶分子強力吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴增,再進(jìn)行下一輪洗脫。經(jīng)過 3～5輪的“吸附—洗脫—擴增”后,與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。而后通過測序分析可以得到多肽基序而用于下一步的疫苗研究、診斷元件構(gòu)建或其它目的[10,11]。

2.2 肽庫的構(gòu)建

噬菌體隨機肽庫是由上億種與噬菌體外殼蛋白以融合的形式呈現(xiàn)在噬菌體表面的多肽所組成,庫中上億種多肽分別呈現(xiàn)在上億個噬菌體表面,眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機肽庫。構(gòu)建肽庫的關(guān)鍵是獲得足夠的獨立噬菌體克隆。以 6肽為例,至少應(yīng)獲得 107～109以上的獨立克隆。肽庫的建立基于以下事實:(1)含有關(guān)鍵殘基的小肽可以模擬蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(抗原決定簇);(2)蛋白質(zhì)之間的相互作用及識別是通過局部肽片段的相互作用實現(xiàn)的。噬菌體肽庫技術(shù)是噬菌體展示技術(shù)同生物進(jìn)化理論相結(jié)合的產(chǎn)物。

在噬菌體展示隨機多肽庫的構(gòu)建策略中,大多數(shù)的肽庫是將隨機多肽片段與 pⅢ的N末端融合而展示于噬菌體表面,也有一部分肽庫采用pⅧ的N端展示。pⅢ允許展示較大的蛋白質(zhì),大至 50 ku的蛋白質(zhì)己被成功展示,其在病毒顆粒上只含有少數(shù)幾個拷貝,因而對于獲得高親和力的多肽很有好處,故pⅢ幾乎是目前所有噬菌體展示庫的骨架。而pⅧ只能融合較小的外源肽段,攜帶肽段太大會影響噬菌體粒子的組裝與感染能力,但其拷貝數(shù)高,重組噬菌體作為免疫原時,可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng),在疫苗研制中應(yīng)用價值大。

目前,肽庫的構(gòu)建主要有兩種途徑:一是有機合成法,二是基因合成法。前者是直接用固相肽合成技術(shù),合成含有各種可能序列的短肽?；蚬こ谭椒ㄊ菍⒕幋a各種序列特定長度短肽的目的基因克隆進(jìn)表達(dá)載體,與噬菌體的外殼蛋白基因融合表達(dá),使得一個噬菌體上含有一種序列的肽。目前使用的噬菌體載體大多是在pⅢ或 pⅧ基因區(qū)通過定點突變引入適宜的酶切克隆位點,同時在其下游插入抗生素抗性基因和包含復(fù)制起始位點的DNA片段構(gòu)建而成。

2.3 噬菌體肽庫的分類

噬菌體肽庫依據(jù)外源融合多肽的構(gòu)象是否被限制,可分為兩類:一類為展示于噬菌體表面的多肽,其構(gòu)象不受限制,即沒有束縛其外源融合多肽構(gòu)象的二硫鍵存在,呈線性狀態(tài);另一類為構(gòu)象限制的肽庫,其特點是外源隨機肽兩側(cè)各有一個 Cys殘基,在噬菌體表面形成二硫鍵,它與受體的親和力比線性肽庫要高。在篩選受體的相應(yīng)配基時,使用構(gòu)象限制性肽庫比使用完全隨機肽庫更容易獲得成功。另外,噬菌體肽庫依據(jù)展示于噬菌體外膜上外源融合多肽的拷貝多少形式的不同,可相應(yīng)地分為單價多肽噬菌體庫和多價多肽噬菌體庫。目前,根據(jù)噬菌體載體的不同,噬菌體展示系統(tǒng)主要分為:絲狀噬菌體系統(tǒng)、λ噬菌體系統(tǒng)、T4噬菌體系統(tǒng)以及T7噬菌體系統(tǒng)。

2.4 噬菌體肽庫的篩選方法

目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的噬菌體展示肽庫篩選方法有很多種,如:固相純化抗原篩選、液相篩選法(磁珠篩選)、全細(xì)胞篩選、動物體內(nèi)篩選、血清篩選等。能否從肽庫中篩到特異性強的噬菌體克隆受到多個因素的影響,其中,篩選方法的合理應(yīng)用在很大程度上起著決定性作用。

2.4.1 固相篩選法 固相純化抗原篩選最早的辦法是用抗原包被 ELISA板,方法與常規(guī)的ELISA方法相似,但抗原濃度要適當(dāng)提高。近年來,不斷有文獻(xiàn)報道通過改進(jìn)固相篩選方法取得了很好的效果[12,13]。

固相篩選法操作簡單,篩選出陽性克隆的幾率高,但需要純化大量的靶蛋白純品,而且不易根據(jù)抗體庫和抗原的性質(zhì)進(jìn)行量化處理,因而針對抗體的親和力有所選擇時此法效果欠佳。同時,固相篩選出的抗體有時不能與天然抗原結(jié)合,并且要求抗體庫的庫容量較大。

2.4.2 液相篩選法 液相篩選法將抗原用生物素標(biāo)記后在液相中利用鏈親和素磁珠借助磁場的作用進(jìn)行多肽噬菌體篩選。其優(yōu)點是增加了噬菌體顆粒與抗原接觸的幾率,提高了篩選效率;篩選體系可以根據(jù)抗體庫的庫容、抗原的相對分子量和純度等對篩選體系進(jìn)行調(diào)整;可預(yù)先確定所期望抗體的親和力,選擇性地篩選到不同親和力的噬菌體抗體[14]。但是液相篩選獲得的克隆特異性比較差。

2.4.3 體內(nèi)篩選法 體內(nèi)篩選方法將常規(guī)的噬菌體展示技術(shù)與動物荷瘤模型相結(jié)合,進(jìn)行腫瘤或其內(nèi)部血管上特定配體的篩選。體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)除了具備常規(guī)的噬菌體隨機肽庫快速、高效的特性外,還因為該篩選過程主要在動物體內(nèi)進(jìn)行,能夠充分模擬人體內(nèi)環(huán)境,并最大程度地保持感興趣組織或細(xì)胞上各種配體的天然構(gòu)象,可以較好地評價目標(biāo)篩選物親和吸附的特異性及偶聯(lián)藥物后的臨床效果[15]。但是體內(nèi)篩選的特異性較差,容易篩得與血管壁或成纖維細(xì)胞等其他非特異性的噬菌體。而且,體內(nèi)篩選周期長、操作復(fù)雜,容易出現(xiàn)噬菌體序列的丟失。

2.4.4 全細(xì)胞篩選法 全細(xì)胞篩選可以獲得針對細(xì)胞膜表面分子的特異性多肽,而且細(xì)胞膜表面分子以天然狀態(tài)存在,應(yīng)用此方法篩選更容易獲得有功能的小肽[16]。并且全細(xì)胞篩選具有簡單、高效的優(yōu)點,在篩選過程中試驗條件可控性強、影響因素小,實驗結(jié)果重復(fù)性高,是最常用的方法。但是細(xì)胞表面的目的蛋白含量較低,蛋白成分復(fù)雜,篩選的難度很大。

不同的篩選方法各具優(yōu)勢,在實際的篩選過程中,應(yīng)當(dāng)根據(jù)抗體庫的庫容、抗原的性質(zhì)和純度、篩選的目的,合理地選擇篩選方法,從而獲得更有效的結(jié)果。

3 噬菌體展示肽庫技術(shù)在分子病原細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用

近年來,噬菌體隨機肽庫技術(shù)不斷被改進(jìn)和完善,在生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,在分子病原細(xì)菌學(xué)方面的應(yīng)用主要表現(xiàn)在抗原表位篩選[5,17]、免疫學(xué)診斷[18～20]、疫苗研制、藥物篩選及靶向投遞[16]等方面。

3.1 抗原表位研究

抗原表位是抗原分子中與抗體或致敏的淋巴細(xì)胞結(jié)合的部位,有線性表位和構(gòu)象型表位兩種類型,線性表位的氨基酸序列在一級結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的,而構(gòu)象型表位是由一級結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的氨基酸殘基經(jīng)過肽鏈折疊而在空間聚集在一起形成的一定的空間結(jié)構(gòu)。在完整蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗血清中,抗構(gòu)象型表位的抗體占 90%,只有 10%的抗線性表位抗體。

傳統(tǒng)的抗原表位分析主要是通過分析抗原經(jīng)物理化學(xué)降解得到的片段或人工合成一系列來源于抗原的肽段與相關(guān)抗體的結(jié)合活性而得到,此方法成本高,必須首先確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列,才能合成相應(yīng)的肽,而在實際研究中,許多蛋白質(zhì)的序列并不清楚。此外,由于表位多數(shù)情況下為包含結(jié)合受體所必需的某些氨基酸不連續(xù)的空間構(gòu)象,僅少數(shù)為一段連續(xù)的線性氨基酸殘基,因此線性的合成肽僅能模擬蛋白質(zhì)的線性表位,無疑會丟失眾多的構(gòu)象型表位信息。

噬菌體肽庫技術(shù)將抗體作為受體暴露于肽庫中篩選到能與特異性抗體相結(jié)合的重組噬菌體肽的序列,彌補了合成肽篩選的不足。噬菌體隨機肽庫技術(shù)研究分析抗體所識別的抗原表位具有以下優(yōu)點:(1)噬菌體多肽易生產(chǎn)和分離,價廉;(2)噬菌體穩(wěn)定且保存時間長;(3)可進(jìn)一步改造以滿足不同的需要;(4)噬菌體具有免疫原性,因而作為疫苗免疫時無需佐劑;(5)提供了一種快速鑒定免疫優(yōu)勢中和抗原決定簇的有效方法。

目前,以純化的單抗為靶標(biāo)篩選抗原模擬表位的應(yīng)用最廣泛也最為成熟,為在未知條件下分離病原體的表位,或作為診斷試劑提供了廣闊的應(yīng)用前景。國外學(xué)者已成功地篩選到不連續(xù)的與原始抗原沒有同源性的乙肝病毒(HBV)[21]、丙肝病毒(HCV)[22]、人類免疫缺陷病毒(HIV)gp 120蛋白[23]的模擬表位序列,這些序列均具有很強的免疫原性,不需要添加任何佐劑,所激發(fā)的抗體既能識別模擬表位抗原也能識別原始抗原。這些模擬表位抗原可以避免完整抗原的毒性作用并可以避免產(chǎn)生不需要的非中和抗體。同時利用噬菌體隨機肽庫還可以模擬一些半抗原和不具有免疫原性的物質(zhì),從而研制一些模擬肽藥物,如對肺炎球菌等一些細(xì)菌疫苗的研制都從模擬肽入手獲得了一定突破[24]。郭奕陽等[25]借助基因工程手段獲取了含有McAb2相應(yīng)表位的融合蛋白及預(yù)期表位缺失蛋白,并利用噬菌體肽庫篩選 McAb2結(jié)合的關(guān)鍵位點,進(jìn)而對該結(jié)合位點是否與 FH和 Fba蛋白的結(jié)合位點相重疊進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步探索 Fba蛋白在GAS致病機制中的作用,鑒定 McAb2的功能及制備表位肽疫苗奠定了基礎(chǔ)。李妍等[26]通過利用噬菌體隨機肽庫技術(shù)篩選出 THp主要保護性抗原UreaseB,Lpp20,Catalase的B細(xì)胞表位,從而初步建立了Hp主要保護性抗原 B細(xì)胞表位鑒定的研究平臺,為Hp表位疫苗的研制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

3.2 免疫診斷研究

感染性疾病患者血清中含有針對抗原的各種抗體,但只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表達(dá)的情況下才容易獲得純抗原來鑒定特異性的抗體,而利用噬菌體隨機肽庫技術(shù)篩選到的小肽分子可以和患者體內(nèi)的抗體相結(jié)合,從而發(fā)現(xiàn)患者血清中的特異抗體,可由此用于快速、特異性地診斷疾病。

Nathan等[27]構(gòu)建了 1個針對熱帶病原菌(類鼻疽桿菌屬)的人鼠嵌合抗體 Fab庫,并利用此庫篩選出針對蛋白酶的克隆,分析了其作為蛋白酶抑制劑的功能。體外實驗證明,純化的 Fab有抑制該蛋白酶的能力,并對致病性蛋白酶有專屬性。Saldarelli等[28]應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)建立了人源重組抗體庫,從中獲得 15株對B型葡萄病毒有特異性的重組ScFv抗體。其中 2株的編碼基因在重組中以二聚體形式表達(dá),用該二聚體ScFv抗體成功地在草本植物,葡萄樹的組織中直接檢出了 B型葡萄病毒,該抗體被認(rèn)為可有效代替 B型葡萄病毒的多克隆血清,建立新的 DAS ELISA試驗標(biāo)準(zhǔn),用于常規(guī)診斷。

3.3 基因疫苗研究

運用肽庫的最大優(yōu)點是不需要靶蛋白的任何結(jié)構(gòu),只需利用其抗體或受體來捕獲噬菌體肽庫中的小配體,并可大量繁殖,這為疫苗的設(shè)計生產(chǎn)提供了極大方便。利用噬菌體展示肽庫親和淘篩可以得到一些抗原的模擬表位,這些模擬抗原除了能模擬天然抗原的結(jié)構(gòu)外,還具有一定的免疫原性,能像天然抗原一樣刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng),由它產(chǎn)生的抗體能與真正病原體上的天然表位反應(yīng),這有利于將發(fā)現(xiàn)的表位作為人工合成疫苗的一個組分,在疫苗設(shè)計方面有著廣泛的應(yīng)用前景[29]。

非典型嗜血流感桿菌(NTHi)是導(dǎo)致兒童中耳炎和成人下呼吸道疾病的常見原因。到目前為止,尚無有效的疫苗來防治。NTHi的一個主要表面蛋白混合寡糖(LOS)是重要的毒力因子。LOS毒力很強,以致于在體內(nèi)很難被控制,但是去毒的 LOS是不依賴于T細(xì)胞的小分子,而且在體內(nèi)的免疫原弱。Hou等[30]將噬菌體展示 12肽庫與抗 NTHi LOS的兔抗體反應(yīng),以期得到模擬LOS抗原。結(jié)果表明,得到的合成肽使兔產(chǎn)生了一定的抗NTHi LOS能力。

3.4 抗菌藥物的靶向投遞

傳統(tǒng)的新藥開發(fā),由于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系不夠了解,只能通過大規(guī)模的定點突變和費時的單個目的蛋白的克隆表達(dá)純化與篩選來修飾現(xiàn)有蛋白。

隨著人類對細(xì)胞認(rèn)識的不斷深入,人們更多從分子水平來闡述細(xì)胞間的作用機制[31]。已經(jīng)明確,受體是細(xì)胞同外界聯(lián)系的通道,各種生物因子(包括某些藥物)都是通過同受體結(jié)合而產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。而噬菌體展示肽技術(shù)只要以一定功能的靶分子為受體,在天然蛋白質(zhì)或特定功能的框架分子噬菌體展示文庫中篩選配體,就可以簡便快速地獲得與靶分子具有強親和力和特異性的小肽或新型蛋白,可作為受體的激動劑或拮抗劑[32],分析其結(jié)構(gòu)就可以合成相應(yīng)的藥物,作為候選藥物或用于抗菌藥物的靶向投遞。

噬菌體隨機肽庫技術(shù)用于病原菌導(dǎo)向治療研究主要集中在 3個方面:①篩選病原菌抗原表位特異性結(jié)合肽,與藥物耦聯(lián)后用于病原菌的藥物靶向投遞和治療;②篩選與病原菌致病性相關(guān)蛋白的結(jié)合肽,為病原菌免疫診斷提供了一個有前途的方法;③篩選病原菌相關(guān)抗原表位和蛋白結(jié)合肽后與基因耦聯(lián),用于藥基因疫苗設(shè)計和基因治療。

4 問題與展望

噬菌體肽庫對于連續(xù)、不連續(xù)的或非肽表位(即糖蛋白)都具有良好的篩選作用,是研究復(fù)雜生物系統(tǒng)有用的工具。通過篩選得到的生物活性肽是構(gòu)建“生物導(dǎo)彈”的基礎(chǔ),至今據(jù)報道建立在這種基礎(chǔ)上的腫瘤導(dǎo)向治療表現(xiàn)出高效性和高安全性,其在病原細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用也越來越受國內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注。

當(dāng)然需要指出的是,噬菌體的建庫過程仍然依賴于 DNA的轉(zhuǎn)化,因而實際存在的肽庫的多樣性是有限的。肽本身的單一性也限制了對于復(fù)雜蛋白質(zhì)分子的研究。而且篩選到的具有高親和力的生物活性肽與抗微生物藥物結(jié)合必須以不改變兩者特異性為前提,在結(jié)合后也應(yīng)以病原體抗原表位為靶標(biāo)實現(xiàn)準(zhǔn)確地導(dǎo)向殺傷。雖然這樣,我們?nèi)匀豢梢杂秒S機肽庫篩選出的新的配體成為基因或藥物傳遞治療的載體,為病原菌治療開辟一條新途徑。

總之,噬菌體肽庫是噬菌體展示技術(shù)在近些年來發(fā)展起來的重要分支,其具有高庫容、高效方便及靈活的篩選技術(shù)等特點,使其在許多方面如功能基因組學(xué)、藥物設(shè)計和尋找新配體等占有重要地位。隨著篩選靶標(biāo)范圍的擴展及相應(yīng)的更加完善的篩選方法的建立,噬菌體展示肽庫技術(shù)必將為生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展,尤其是病原菌方面的研究和應(yīng)用帶來巨大的推動。

[1] 劉世明,李民友,鐘赟,等.抗人 B型鈉尿肽噬菌體抗體庫的構(gòu)建及噬菌體抗體的篩選[J].廣東醫(yī)學(xué),2006,27(12):1 783-1 785.

[2] SMITH G P.Filamentous fusion phage:novel exp ression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science,1985,228:1 315-1 317.

[3] 李華,鄭萍,郭波,等.利用噬菌體肽庫技術(shù)獲得與人Fas結(jié)合的多肽基序[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(9):689-694.

[4] YIP Y L,WARD R L.Epitope discovery using monoclonal antibodies and phage peptide libraries[J].Combinatorial Chemistry＆High Throughput Screen,1999,2:125-138.

[5] SCOTT JK,SMITH G P.Searching for peptide ligandswith an epitope library[J].Science,1990,249:386.

[6] BAMESJ,LUCY C P,PATRICIA E D.Random peptide libraries:A source of specific protein in bindingmolecules[J].Science,1994,249:404-406.

[7] PREZZIC,NUZZOM,MEOLA A,et a1.Selection of antigenic and immunogenic mim ics of hepatitis C virus using sera from patients[J].The Journal of Immunology,1996,156:4 504-4 513.

[8] IBA Y,LTOW,KUROSAWA Y.Expression vector for the inundation of lightly diverged sequence into the six complementarily-determining region of an antibody[J].Oene,1997,194:35-36.

[9] SMITH G P,PETRENKO V A.Phage display[J].Chem Res,1997,97:391-410.

[10] SIDHU SS,LOWMANH B,CUNNINGHAM BC,etal.Phage disp lay for selection ofnovelbinding peptides[J].Methods Enzymol,2000,328:333-363.

[11] SIDHU SS.Phage display in pharmaceutical biotechnology[J].Current Opinion in Biotechnology,2000,11(6):610-616.

[12] GOLETZ S,CHRISTENSEN P A,KRISTENSEN P,etal.Selection of large diversities of antiidiotypic antibody fragments by phage display[J].JMol Biol,2002,315(5):1 087-1 097.

[13] YU H Q,DONG X Y,SUN Y.An altemating elution strategy for screeninghigh affinity peptides from a phage display peptide library[J].Biochem Eng,2004,18(3):169-175.

[14] GRIFFITHS A D,W ILLIAMS SC,HARTLY O,et al.Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires[J].EMBO J,1994,13(14):3 245-3 260.

[15] 潘琴,石磊,臧林泉,等.肺癌特異性結(jié)合肽的體內(nèi)篩選及初步鑒定[J].山東醫(yī)藥,2008,48(33):27-28.

[16] LOU J,MARZARIR,VERZILLO V,etal.Antibodies in haystacks:how selections strategy influences the outcome of selection from molecu lar diversity libraries[J].J Immun Methods,2001,253(1-2):233-242.

[17] WU G,FAN X,WU H,et al.Bioscreening of phage disp lay antibody library and expression ofa humanized single-chain variable fragment antibody againsthuman connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)[J].Biotechnol App l Biochem,2010,56(3):95-102.

[18] WANG L F,YU M.Epitope identification and discovery using phage display libraries:applications in vaccine development and diagnostics[J].Curt Drug Targets,2004,5(1):1-15.

[19] KOOHAPITAGTAM Maneerat,RUNGPRAGAYPHAN Suang,HONGPRAYOON Ratchanee.Construction of Single-Chain Variable Fragment(scFv)Specific to Cucumber Mosaic Virus by Phage Display Technology[J].Kasetsart J(Nat Sci),2009(43):330-338.

[20] CHRISTENSEN D J,GOTTLIN E B,BENSON R E,etal.Phage display for target-based antibacterial d rug discovery[J].Research Focus,2001,6(14):721-727.

[21] MOTTIC,NUZZO M,MEOLA A,et al.Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAgm imotopes selected from an M 13 phage display library[J].Gene,1994,146(2):191-198.

[22] RODRIGUEZ-LOPEZM,RIEZU-BOJ JI,RUIZM,et al.Immunogenicity of variable regions of hepatitis C virus proteins:selection andmodification of peptide epitopes to assess hepatitis C virus genotypes by ELISA[J].JGen Virol,1999,80(Pt3):727-738.

[23] GRIHALDE N D,CHENY C J,GOLDEN A,et al.Epitopemapping of anti-H IV and anti-HCV monoclonal antibodies and characterization of epitopemim ics using a filamentous phage pep tide library[J].Gene,1995,166(2):187-195.

[24] LESINSKIS Gregory B,SMITHSON S Louise,SRIVASTAVA Neeti,et al.A DNA vaccine encoding a peptide mimic of Streptococcus pneumoniae serotype 4 capsular polysaccharide induces specific anti-carbohydrate antibodies in Balb/cmice[J].Vaccine,2001,19(13-14):1 717-1 726.

[25] 郭奕陽.A族鏈球菌表面蛋白Fba單克隆抗體對應(yīng)表位的鑒定及研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2009.

[26] 李妍.幽門螺桿菌主要保護性抗原的基因克隆、表達(dá)、單克隆抗體制備及其B細(xì)胞表位的鑒定[D].廣州:第一軍醫(yī)大學(xué),2007.

[27] NATHAN S,RADER C,CARLOS B F.Neutralization of Burkholderia pseudomallei p rotease by Fabs generated through phage display[J].Biosci Biotech Biochem,2005,69(12):2 302-2 311.

[28] SALDARELLI P,KELLER H,SCHOTS A,et al.Isolation of recombinant antibodies(scFvs)to grapevine virus B[J].Journal of Virological Methods,2005,124(12):191-195.

[29] BERGER M,SHANKAR V,VAFAIA,et al.Therapeutic app lications ofmolecular antibodies[J].Am JMed Sci,2002,324:14-230.

[30] HOU Y,GU X X.Development of pep tidem inotopes of lipooligosaccharide from nontypeable haemophilus in fluenzae as vaccine candidates[J].J Immunol,2003,170(8):4 373-4 379.

[31] JAW W,ROBERTSRW.G-protein-directed ligand discovery with pep tide combinatorial libraries[J].Trends Biochem Sci,2005,30(6):318-324.

[32] H Schooltink,SRose-John.Designing cytokine variants by phage display[J].Comb Chem H igh Throughput Screen,2005,8(2):173-179.

(責(zé)任編輯:朱寶昌)