抗菌肽的研究進(jìn)展

刁昱文,趙紅蕾,高 宇,劉珊珊,馮 新,雷連成,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

自從青霉素發(fā)現(xiàn)以來,抗生素一直是人類治療病原微生物感染的有力武器,但是由于人類對(duì)抗生素的持續(xù)使用和濫用,導(dǎo)致很多細(xì)菌和病毒對(duì)現(xiàn)有的抗生素都產(chǎn)生了耐藥性。NDM-1超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn),更是引起了世界對(duì)病菌耐藥性問題的極大重視乃至恐慌[1]。歐洲專家預(yù)計(jì),至少 10年內(nèi)沒有抗生素可以有效對(duì)付這種細(xì)菌,因此呼吁全球密切監(jiān)控阻止超級(jí)細(xì)菌傳播,更迫切的需要尋找具有全新機(jī)制殺傷病原微生物,且不易形成耐藥性的新型微生物制劑。

1 抗菌肽概述

1950年在弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素的同時(shí),在血細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了具有廣譜抗菌活性物質(zhì)的存在[2]。隨后在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了可以對(duì)感染發(fā)生作用的細(xì)胞內(nèi)的陽離子抗菌肽,其作用與昆蟲的先天免疫細(xì)胞相同[3,4]。1974年,瑞典科學(xué)家G.Boman等向眉紋天蠶蛾(Sam ia Cynthia)蛹注入大腸桿菌后,在血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的堿性多肽類物質(zhì),隨后誘導(dǎo)惜古比天蠶(Hyalophra Cecropia)蛹也發(fā)現(xiàn)了類似的抗菌活性物質(zhì)[5,6]。1981年,這種具有抗菌活性的物質(zhì)被命名為 cecropin[7],這是人們第一次真正意義上發(fā)現(xiàn)抗菌肽。1983年 Lehrer和Selsted從兔的肺巨噬細(xì)胞中純化出兩種抗菌肽,隨后被命名為defensins[8]。在隨后的研究中,從哺乳動(dòng)物、兩棲類、魚類、昆蟲類、鳥類和植物中均發(fā)現(xiàn)了抗菌肽[9～13]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其分子量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌高效廣譜,抗菌機(jī)理不同于抗生素,對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒有作用,僅作用于原核細(xì)胞,同時(shí)不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,而且對(duì)真菌、病毒、原蟲和腫瘤細(xì)胞有一定殺傷作用,具備新型藥物開發(fā)的巨大潛力[15～17],據(jù)最新統(tǒng)計(jì),在線數(shù)據(jù)庫中(http://aps.unmc.edu/AP/main.phe.)已有 2 000多種不同來源的抗菌肽被收錄。

抗菌肽根據(jù)內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和氨基酸不同可分為α螺旋蛋白類、富含色氨酸的 AMPs、含有二硫鍵的 AMPs、富含脯氨酸的昆蟲抗菌肽、Cationic peptide-antisense oligonucleotide Hybrids、陽離子多肽的抗菌擬肽、乳酸桿菌和鏈球菌產(chǎn)生的抗菌肽、多粘菌素[18～20]。

2 抗菌肽的主要研究熱點(diǎn)及發(fā)展趨勢(shì)

2.1 新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與鑒別

發(fā)現(xiàn)并鑒定新型抗菌肽仍是國內(nèi)外研究者所關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著研究水平的不斷提高,新型抗菌肽發(fā)現(xiàn)的速度與數(shù)量與日俱增。目前分離鑒定最直接的方法是通過給予待測(cè)生物特定的刺激或不刺激,收集分泌物,以蛋白純化方法直接分離,通過質(zhì)譜鑒定。將蛋白質(zhì)組學(xué)和肽組學(xué)技術(shù)運(yùn)用到抗菌肽的分離與鑒定,是獲得新的抗菌肽的更為可取的方法。構(gòu)建皮膚組織的 cDNA文庫,結(jié)合特定的篩選策略,高通量的篩選特定種類的多肽全長(zhǎng)的 cDNA編碼序列,通過基因工程方法進(jìn)行表達(dá)或人工合成來獲得純的抗菌肽進(jìn)行生物學(xué)活性研究。

僅在 20世紀(jì)70～90年代,歐洲、美洲、非洲、澳洲的研究者們就對(duì)其本土的兩棲類動(dòng)物皮膚分泌液中的活性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了大規(guī)模的調(diào)查研究和開發(fā)利用工作,發(fā)現(xiàn)了上百種的兩棲類動(dòng)物皮膚活性多肽。中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所的賴仞等從單個(gè)無指盤臭蛙克隆得到了 372條抗菌肽序列,他們編碼 107條新的抗菌肽,分別屬于 30個(gè)不同的抗菌肽家族。這一發(fā)現(xiàn)使得目前發(fā)現(xiàn)的兩棲類抗菌肽數(shù)目增加了 2倍 。

2010年,Mechkarska等從去甲腎上腺素刺激負(fù)子蟾科非洲爪蛙的皮膚分泌物中,分離鑒定出 9種具有抗菌活性的抗菌肽,其中,1個(gè)多肽是 magainin-2的同源類似物,2個(gè)是 PGLa的同源類似物,1個(gè)雨蛙肽前體,1個(gè)爪蟾肽前體,4個(gè) CPF等。研究顯示對(duì) Escherichia coli和 Staphylococcus aureus均有抑菌活性[22]。

本研究室以牛蛙皮膚中提取的mRNA為材料,構(gòu)建牛蛙皮膚 cDNA文庫。利用 PCR方法對(duì)文庫進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn) 6個(gè)新抗菌肽序列,根據(jù)序列特征可分為 3個(gè)家族:Catesbeianin-1,Ranacyclin,Temporin。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽進(jìn)行了生物學(xué)活性測(cè)定,同時(shí)發(fā)現(xiàn)Temporin對(duì)革蘭氏陽性菌有著很好的殺菌作用[23]。

2.2 抗菌肽的設(shè)計(jì)

抗菌肽分子設(shè)計(jì)是一個(gè)相當(dāng)活躍的領(lǐng)域,多學(xué)科交叉在這里得到了充分體現(xiàn)。伴隨每一種新抗菌肽的發(fā)現(xiàn),都會(huì)進(jìn)行氨基酸序列的修飾,目的是尋找對(duì)抗菌活性影響的關(guān)鍵部位,并進(jìn)一步進(jìn)行分子設(shè)計(jì),以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行序列修飾包括以下內(nèi)容,即增加、刪除、或替代 1個(gè)或多個(gè)殘基,截取肽鏈N端或C端部分序列,連接不同自然來源的抗菌肽片段成為雜合肽等。

2.2.1 靶向性抗菌肽的設(shè)計(jì) 在對(duì)抗菌肽的抗菌活性研究的同時(shí),有研究者注意到,一些抗菌肽在治療黏膜感染時(shí),并不能對(duì)有益菌群和致病菌群進(jìn)行選擇性殺傷,有益菌群的破壞,很有可能導(dǎo)致二次感染。靶向性抗菌肽的設(shè)計(jì),可以只對(duì)致病菌進(jìn)行殺傷,從而維持正常菌群的生長(zhǎng)。

Steven A等設(shè)計(jì)了一個(gè)含有固定環(huán)狀抗菌肽,基于穩(wěn)定的胱氨酸 β折疊股框架,這個(gè)框架模擬可能的 LPS結(jié)合位點(diǎn),對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌 E.coli在抗菌肽最低濃度 20 nmol/L時(shí),有著有效的殺菌效果,選擇效果高于革蘭氏陽性細(xì)菌S.aureus 200倍[24]。

Eckert等通過化學(xué)合成法,將沒有殺滅門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)能力的特異性靶向定位區(qū)域(KH)與廣譜 AMP(novinspirin G10)融合,合成了能選擇性地殺滅門多薩假單胞菌的G10KHc。G10KHc的靶向定位能力由KH分子與細(xì)菌的選擇性結(jié)合引起,說明KH選擇性地傳遞G 10KHc至門多薩假單胞菌表面后,AMP區(qū)域快速破壞外膜,增強(qiáng)穿透細(xì)胞質(zhì)膜的能力引起細(xì)胞死亡[25]。

在 Eckert研究基礎(chǔ)上,He等設(shè)計(jì)并合成了具有雙靶點(diǎn)特意性的AMM8(KH)-20。體外實(shí)驗(yàn)表明,M8(KH)-20可以對(duì)門多薩假單胞菌和變異鏈球菌(Streptococcusmutans)有著特異性靶向殺滅作用,并對(duì)共同培養(yǎng)的其它非靶向病原菌的影響較小[26]。

2.2.2 生物信息序列分析 伴隨著生物軟件和相關(guān)網(wǎng)站的發(fā)展,運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、功能預(yù)測(cè)和新序列設(shè)計(jì)已經(jīng)成為生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)交叉運(yùn)用的熱點(diǎn)。

將化學(xué)信息學(xué)、生物信息學(xué)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合應(yīng)用,可以進(jìn)行新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)、抗菌肽的功能預(yù)測(cè)、方法分析,對(duì)在線搜索結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)和對(duì)比,還可以進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析。網(wǎng)站有http://www.expery.Org等,軟件有 Accelrys公司的 Insight II三維圖形環(huán)境軟件包。免費(fèi)軟件:蛋白序列分析軟件包ANTHEPROT,DNASTAR等包括了蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域所包括的大多數(shù)內(nèi)容,功能非常強(qiáng)大,能進(jìn)行各種蛋白序列分析與特性預(yù)測(cè)。

Sarah R等應(yīng)用聚類分析的方法,對(duì)具有抗腫瘤活性的抗菌肽,按照靜電荷數(shù)目,平均疏水力矩和平均疏水性 3個(gè)參數(shù)進(jìn)行了聚類分析。經(jīng)過分析得出,疏水性是抗菌肽進(jìn)行穿膜的關(guān)鍵因素[27]。

孫雁霞等對(duì) defensin抗菌肽進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。一級(jí)結(jié)構(gòu)表明其具有典型的昆蟲防御素特征。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明 defensin抗菌肽中主要的結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋。通過對(duì)不同物種 defensin抗菌肽的分析結(jié)果表明,非陽離子抗菌肽的作用機(jī)制可能是疏水作用力起主導(dǎo)作用,或者是與細(xì)菌胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)菌胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響有關(guān)[28]。

Tossi等自建的數(shù)據(jù)庫廣泛收集了 800多條抗菌肽,這些抗菌肽中基于不同的生物來源,能形成兩親α-螺旋的有 150多條。將其 N端 20個(gè)氨基酸殘基根據(jù)不同類型(電性、極性、螺旋穩(wěn)定性等)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得出了序列模板:ghhp+hxpxh+phh+xhhxh[29]。Tiozzo等以該序列模板為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)出類似于哺乳動(dòng)物中抗菌肽 cathelicidin家族的新型肽 PGY a(PGY a:G LLRRLRDF LKKIGEKFKKIGY-NH 2)[30]。在此基礎(chǔ)上,G iangaspero等用這個(gè)模板研究物理化學(xué)參數(shù)對(duì)活性的影響,通過序列變化合成了 20條肽鏈,得到了一系列具有參考價(jià)值的結(jié)論,這在某種程度上對(duì)多樣性抗菌序列進(jìn)行了一個(gè)總結(jié),為單獨(dú)對(duì)個(gè)別肽鏈進(jìn)行分子設(shè)計(jì)提供了參考[31]。

2.3 抗菌肽在先天性免疫中的作用

先天性免疫是提供給有機(jī)體對(duì)抗致病微生物侵襲的快速的第一道防線。由于抗菌肽可以對(duì)多種致病微生物快速發(fā)揮功能,所以宿主來源的抗菌肽一直被認(rèn)為是機(jī)體的“天然抗生素”,其特點(diǎn)是來源多樣,并且參與先天性免疫的各個(gè)環(huán)節(jié)而成為新的治療藥物的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)[14,32～33]。

Territo等[34]首次證明,α-defensins是人類單核細(xì)胞的趨化因子。Scott等[35]發(fā)現(xiàn)了可以選擇性地調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)的抗菌肽。Scott設(shè)計(jì)的13個(gè)氨基酸的非毒性多肽IDR-1(KSRIVPAIPVSLL-NH 2)可以減弱促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,同時(shí)促進(jìn)單核細(xì)胞的選擇性聚集,增強(qiáng)和維持單核巨噬細(xì)胞炎癥趨化因子水平。

感染或損傷處所分泌的Cathelicidins和defensins對(duì)效應(yīng)細(xì)胞具有趨化性,誘導(dǎo)化學(xué)激活素的轉(zhuǎn)錄及分泌和肥大細(xì)胞的組胺釋放,這些反應(yīng)共同促進(jìn)先天的及獲得性免疫細(xì)胞的補(bǔ)充。Cathelicidin家族的抗菌肽能夠抑制致炎細(xì)胞因子如TNF-α,IFN-r和 IL-6的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、促炎癥反應(yīng)物質(zhì)的釋放及避免細(xì)菌感染后嚙齒類的膿毒癥,還能防止引起組織損傷和炎癥的毒性組分的產(chǎn)生,Cathelicidin家族抗菌肽還可通過調(diào)節(jié)TLR 4來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[36]。

2.4 抗菌肽藥物的開發(fā)利用

2.4.1 抗菌肽在人類疾病和健康的臨床應(yīng)用 目前,人類醫(yī)學(xué)上抗菌肽的研究主要針對(duì)皮膚疾病、呼吸性疾病、腸疾病等一些炎性疾病和由致病微生物所引起的感染性疾病。同時(shí),抗菌肽的抗腫瘤活性也已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可和關(guān)注。

在哺乳動(dòng)物和人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽在人體中主要起的兩個(gè)作用已被證實(shí),一是直接的殺菌特性,二是免疫調(diào)節(jié)特性。應(yīng)用比較多的兩種抗菌肽是Cathelicidin和 defensins,它們的抗菌活性和多向的在感染和炎癥疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用已被證實(shí)。通過具有針對(duì)性和系統(tǒng)性的路線進(jìn)行刺激誘導(dǎo)性給藥而激發(fā)內(nèi)源性抗菌肽,是一種安全的成本低廉的治療方案。同時(shí)還避免了合成類似物所產(chǎn)生的副作用和藥物在體內(nèi)靶向傳遞的困難[37]。

有研究者發(fā)現(xiàn),在皮膚上Cathelicidin對(duì)A型鏈球菌有著明顯的抗菌作用,但是在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)大腸桿菌 B型鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力有所降低[38]。α-defensins HNP-1,HNP-2,HNP-3在體外對(duì)腺病毒有著很強(qiáng)的抗病毒活性,并且對(duì)皰疹病毒、流感病毒和巨細(xì)胞病毒均有抑制活性;HNP-4對(duì)H IV-1感染也有一定的抑制作用[39]。更多的研究發(fā)現(xiàn) β-defensins,以對(duì)抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的感染。另有研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核桿菌感染的人肺泡巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo) HBD-2的表達(dá),說明 HBD-2在人類結(jié)核病的感染中起到一定作用[40]。

抗菌肽已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在特異性皮炎和銀屑病這兩種皮膚疾病的治療中。通過服用 VD3來誘導(dǎo)體內(nèi) LL-37的表達(dá),使用有益菌種或是丁酸鈉來誘導(dǎo)腸內(nèi)抗菌肽的抗感染和抗炎能力[41]。

抗菌肽可能成為一種新型的藥物載體。兩親性抗菌肽的膜穿透性是其作為藥物運(yùn)輸載體的基礎(chǔ),Laszlo Otvos等將分子量小且富含精氨酸殘基的昆蟲抗菌肽 pyrrochoricin和其衍生物作為施藥運(yùn)載工具,可將抗原性較弱的 9個(gè)殘基的MHC-1的抗原表位遞送到小鼠體內(nèi),產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞毒性 T細(xì)胞反應(yīng),證實(shí)pyrrochoricin同系物具有運(yùn)載抗原依賴性疫苗的潛力[42]。Magainin與溶于體積分?jǐn)?shù)為 0.50的乙醇的表面活性劑增強(qiáng)劑 N-月桂酰肌氨酸一起可以破壞皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)結(jié)構(gòu),從而增加了藥物的皮膚透過性,該結(jié)果顯示出抗菌肽作為透皮給藥載體具有很好的發(fā)展前景[43],進(jìn)一步探討抗菌肽作為穿膜肽的應(yīng)用具有廣闊的前景。

抗菌肽的抗腫瘤活性為腫瘤藥物的開發(fā)提供了又一個(gè)研究平臺(tái)。已經(jīng)證實(shí)天蠶素A和B,LL-37/hCAP-18,Magainins,Gaegurins,Aurein 1.2,Citropin 1.1,Melittin(蜂毒肽),Lactoferrici,Tachyp lesin I(鱟素 I),cathelicidin家族中的 PR-39以及一些人工合成的AMPs等有著很好的抗腫瘤活性。在研究AMPs抗腫瘤的同時(shí),研究者通過其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制和對(duì) AMPs本身的改造,使某些抗腫瘤AMPs不僅在抗腫瘤活性上得到提高,并大大增強(qiáng)了 AMPs對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性[15]。

雖然始終有大量的研究人員在對(duì)天然抗菌肽提取、純化、結(jié)構(gòu)驗(yàn)證和改造等各方面不斷地做出成績(jī),但是只有一小部分多肽進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。幾個(gè)很有希望的品種在進(jìn)行三期臨床試驗(yàn)階段宣告失敗。比如MSI-78,臨床實(shí)驗(yàn)是用于治療糖尿病性足潰瘍感染,其療效等同于口服氧氟沙星。同樣在臨床三期就宣告失敗的還有 IB-367和 MBI-226。到目前為止還沒有任何抗菌肽或其衍生物被FDA批準(zhǔn)上市,多是用作食品添加劑、獸藥。所以研發(fā)抗菌肽類藥物還有很長(zhǎng)的路要走。目前很多知名藥物研發(fā)機(jī)構(gòu),如Micrologix仍然對(duì)抗菌肽類藥物進(jìn)行著不懈地探索。其中用于治療過敏性痤瘡的多肽類藥物已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)階段,用于治療 MRSA引起的鼻腔炎癥也進(jìn)入Ⅰb期臨床實(shí)驗(yàn)階段。

2.4.2 代抗生素添加劑 根據(jù)美國相關(guān)科學(xué)家聯(lián)盟的一項(xiàng)研究表明,美國 70%的抗生素應(yīng)用于健康的動(dòng)物,用來增加健康畜禽的體重。2010年 6月 28日,美國食品及藥品管理局(FDA)實(shí)施了進(jìn)一步限制抗生素在動(dòng)物生產(chǎn)上的措施,主要是因?yàn)樵趧?dòng)物飼料中常規(guī)使用抗生素導(dǎo)致出現(xiàn)抗藥性的新細(xì)菌菌株。動(dòng)物食品安全有賴于生產(chǎn)過程的各個(gè)環(huán)節(jié),使用無污染、在動(dòng)物體內(nèi)無殘留、無毒副作用的添加劑是解決問題的關(guān)鍵之一。

抗菌肽是動(dòng)物體成分之一,參與生命過程是小分子短肽具有安全無毒副作用的生物學(xué)特性。抗菌肽眾多的優(yōu)點(diǎn)為其在獸醫(yī)學(xué)和飼料科學(xué)中的應(yīng)用指明了作為可代替抗生素的應(yīng)用方向,尤其是抗菌肽分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng),因此可以耐受飼料制粒時(shí)的高溫,規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)時(shí),經(jīng)高溫濃縮工序,可充分殺滅酵母菌體而不導(dǎo)致抗菌肽失活,產(chǎn)品在推廣應(yīng)用后不會(huì)出現(xiàn)工程菌的擴(kuò)散而導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)問題。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)