李斯特菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展

龍 川,呂亞楠,錢愛東,趙 權(quán)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春,130118)

李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)最早于 1924年由英國劍橋大學(xué)學(xué)者從實(shí)驗(yàn)室患敗血癥大鼠和兔子中分離得到[1]。該菌廣泛存在于土壤、人和動(dòng)物的糞便中,很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴發(fā)。該菌有著獨(dú)一無二的生物學(xué)特征,它能在不同的環(huán)境條件下生長。例如,它可在 2～4℃下生長,在 -18℃可存活,甚至在反復(fù)凍融的條件下仍可存活。該菌最適宜的生長溫度為 30～37℃,最高可忍受 44℃的高溫[2]。由該菌引起的李斯特菌癥能夠使人和動(dòng)物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成懷孕婦女流產(chǎn)、死胎等疾病,且病死率很高。常規(guī)抗生素治療療效一般。2000年,李斯特桿菌病在法國向人類發(fā)起攻擊。法國衛(wèi)生部門 2010年報(bào)道,法國發(fā)現(xiàn) 9人因食用熟肉制品而感染了李斯特桿菌病,其中 2人已經(jīng)死亡[3]。

食品中李斯特菌的傳統(tǒng)檢測方法是將分離純培養(yǎng)后的可疑菌落進(jìn)行生化反應(yīng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、典型運(yùn)動(dòng)等鑒定,被確定為李氏桿菌后進(jìn)一步進(jìn)行血清型分析[4]。傳統(tǒng)的分離方法有FAD法、IDF法、USDA法、冷增菌法(CE)和快速分離程序(RAP-ID程序)。傳統(tǒng)的檢測方法病原的分離率低,耗時(shí)較長,敏感性較差。已經(jīng)越來越不適應(yīng)人們的生產(chǎn)發(fā)展了。

1 血清學(xué)檢測方法

血清學(xué)檢測具有實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單,操作方便,實(shí)驗(yàn)結(jié)果較快的特點(diǎn)。很多病原菌用血清學(xué)手段都能達(dá)到快速的檢測。最初利用血清學(xué)方法檢測李氏桿菌的鞭毛抗體,但是本法特異性較差,不能鑒定復(fù)雜抗原群,因?yàn)楸痉ㄔ诶钍蠗U菌癥病史的動(dòng)物血清中成陽性反應(yīng)。Berche Patriek[5]以純化的李斯特菌檢測血清中抗李斯特菌抗體的Dot-blot法,以診斷是否有李斯特菌感染,效果不錯(cuò),但存在假陽性。據(jù)報(bào)道,李氏桿菌與某些大腸桿菌有共同抗原,由于交叉反映普遍存在故很難利用血清學(xué)方法準(zhǔn)確診斷。用酶免疫分析法(EIA)檢測血清型 1和 4b“M”“O”和“H”抗原,結(jié)果與試管凝集試驗(yàn)相一致,但EIA的滴度高,而且需要的試劑比試管凝集試驗(yàn)少,應(yīng)用光密度測定的結(jié)果較試管凝集試驗(yàn)更客觀。

2 PCR方法檢測李氏桿菌

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法以其快速、簡便、特異性高的特點(diǎn),在生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。Paillard.D和 Fitter S根據(jù)限制性片段長度多態(tài)性的原理,用 PCR方法擴(kuò)增出李斯特氏菌的23SrRNA的兩段保守序列,并通過比較各擴(kuò)增出來的限制性片段長度來檢測李斯特氏菌,可達(dá)到區(qū)分李斯特氏菌不同種的水平[6,7]。依據(jù)李氏桿菌 hlyA基因序列設(shè)計(jì)引物,利用富集培養(yǎng)結(jié)合 PCR擴(kuò)增的方法檢測食品中的 LM,僅需要 24 h或 2 d。Wieckowska.M根據(jù) hly基因建立 PCR法檢測牛奶中的李斯特菌,檢測靈敏度為 50 cfu/L。Cocolin[9]建立了 1種新的檢測鑒定食品中 L.spp和LM的分子方法。用來自 5個(gè)種的iap(invasion associated protein)基因擴(kuò)增片段和PCR產(chǎn)物的變性梯度膠電泳(DGGE),使 5個(gè)種容易得到快速分離和鑒定。近年來,實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)檢測 LMO更快速、敏感、特異,同時(shí)能有效地克服食品基質(zhì)、培養(yǎng)基成分和雜菌對常規(guī) PCR檢驗(yàn)的干擾作用[10]。

3 單克隆抗體法檢測李氏桿菌

單克隆抗體這項(xiàng)技術(shù)一經(jīng)問世就從根本上解決了在抗體制備中長期存在的特異性和可重復(fù)性問題。使抗體的規(guī)模性生產(chǎn)成為可能。人們嘗試制作一種特異性單克隆抗體,能特異的和單核增生性李氏桿菌結(jié)合,用于食品的檢測。目前根據(jù)不同抗原建立了很多檢測方法。Butman在1988年報(bào)道了巧株李斯特氏菌屬特異表位的單克隆抗體,用以上單抗構(gòu)成的夾心 ELISA檢測方法能于前增菌后24 h內(nèi)報(bào)道檢出結(jié)果,最低菌濃度檢出為 5×108cfu/L[11]。焦新安[12]在 1994年應(yīng)用 3株李斯特菌屬特異單抗檢測試劑,建立了快速檢測李斯特菌的間接免疫熒光和夾心ELISA方法。蔣原等[13]運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)獲得4株雜交瘤細(xì)胞可分泌抗李斯特菌屬表位單抗的,特異性高,與其它菌無交叉反應(yīng)。

4 儀器法檢測單克隆抗體

全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)是用儀器檢測李氏桿菌的方法,首先用常規(guī)法篩選可疑菌落,然后用儀器鑒定,國內(nèi)外現(xiàn)在已有很多全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng),如BITEK-AMs系統(tǒng)、vitek系統(tǒng)、Midd系統(tǒng)、Biolog系統(tǒng)、Autosceptor系統(tǒng)等。國際分析化學(xué)協(xié)會(huì)(AOAC)把BITEK-AMS系統(tǒng)列為法定分析法。據(jù)報(bào)道用Vitek微生物自動(dòng)分析儀進(jìn)行李斯特菌鑒定,與傳統(tǒng)方法相比,符合率 100%,僅需 7～14 h就能檢測出結(jié)果,具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[14]。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部研究報(bào)告稱,用“流式細(xì)胞儀”可 1次準(zhǔn)確檢測出 100個(gè)李氏桿菌樣品,可更快速、方便、準(zhǔn)確地檢測李斯特菌。雖然儀器方法操作簡便,準(zhǔn)確率也很高,但仍有它的局限性,此種方法是建立在成熟實(shí)驗(yàn)人員篩選可疑菌落之上的。

5 討 論

未來很長的一段時(shí)間內(nèi),李斯特菌病仍將是世界性的公共衛(wèi)生問題。我國的李斯特菌癥防制仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。客觀技術(shù)條件的制約以及細(xì)菌病原的復(fù)雜性,李斯特菌的快速準(zhǔn)確檢測仍是困擾研究人員的一大難題。環(huán)境中李斯特菌的大量存在和李斯特菌癥的高致死率,使實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確檢測成為亟待解決的問題之一。傳統(tǒng)方法敏感性差,耗時(shí)長已不能適應(yīng)時(shí)代變化。

新的生物技術(shù)手段的應(yīng)用,為解決這一問題打開了另一扇大門。傳統(tǒng)的蛋白層面的研究由于受復(fù)雜抗原性的影響,特異性較差。基因?qū)用嫣貏e是熒光 PCR技術(shù)和核酸探針等技術(shù)的成熟,使研發(fā)一種快速準(zhǔn)確的檢測方法成為可能。國內(nèi)外學(xué)者做出了很多嘗試,取得了一定的成效。但由于受技術(shù)層面的影響不能普及。在我國如何因地制宜,多種檢測手段綜合利用,為李斯特菌病的預(yù)防和診斷做出有效的技術(shù)支持,是我國需要解決的問題。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)