奶牛乳房炎疫苗防治的研究進(jìn)展

高 宇,馮 新,李林溪,趙紅蕾,刁昱文,劉珊珊,顧敬敏,韓文瑜,雷連成

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)又名奶牛乳腺炎,是奶牛乳腺常見(jiàn)發(fā)生的一種炎癥,由多種因素引起,在奶牛群中的發(fā)病率有上升的趨勢(shì),嚴(yán)重影響奶牛業(yè)的發(fā)展,至今尚未有徹底解決的辦法。在我國(guó)每年用于治療奶牛乳房炎的費(fèi)用近億元人民幣,由此可見(jiàn),乳房炎對(duì)奶牛業(yè)的危害是巨大的。奶牛乳房炎發(fā)生原因眾多,包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、支原體、霉形體還有病毒等等。病原體感染和環(huán)境等其他因素的影響都不可忽視?？刂迫榉垦椎陌l(fā)生,其關(guān)鍵問(wèn)題就是做好預(yù)防和治療,還要定期對(duì)牛群進(jìn)行乳房炎的排查,以消除其潛在的隱患。因此,疫苗的開(kāi)發(fā)在防治奶牛乳房炎方面顯得尤為重要。

實(shí)踐證明,利用疫苗控制奶牛乳房炎發(fā)生是可行的。首先,奶牛乳房炎是因乳腺組織感染病原微生物所致,且以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌為主,占整個(gè)乳腺炎病例的 90%以上。其次,利用疫苗控制乳房炎具有無(wú)乳汁殘留、降低乳腺感染的嚴(yán)重程度、控制隱性乳房炎的發(fā)生、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。本研究主要從金黃色葡萄球菌苗、大腸桿菌苗、鏈球菌苗和多聯(lián)苗幾方面闡述疫苗防治在奶牛乳房炎研究中的應(yīng)用,為奶牛乳房炎的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 金黃色葡萄球菌苗

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶,故致病性強(qiáng)[1]。

Karakawa和Vann首次報(bào)道了金黃色葡萄球菌莢膜有 8個(gè)血清型,Sompolinsky等[2]將其擴(kuò)展為 11個(gè)。據(jù)報(bào)道從美國(guó)和歐洲乳房炎乳汁分離的金黃色葡萄球菌中 100%和 98%金黃色葡萄球菌的血清型為 5型、8型和 336型,并且 94%～100%有莢膜多糖,莢膜多糖具有抗吞噬活性且阻止中性粒細(xì)胞識(shí)別抗金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分的抗體[3]。

1.1 現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌苗

目前,研制的金黃色葡萄球菌菌苗或類(lèi)毒素已用于金黃色葡萄球菌性乳房炎的防治中,試驗(yàn)結(jié)果表明,不論是滅活苗,還是活苗,都能提高奶牛自發(fā)性治愈率,降低臨床型乳房炎的發(fā)生率,且活苗免疫后的血清抗體效價(jià)明顯高于滅活苗。

Pankey等[4]利用多種噬菌體型的金黃色葡萄球菌裂解物研制的疫苗,發(fā)現(xiàn)可提高臨床型乳房炎的自愈率,但對(duì)降低乳腺內(nèi)再感染效果并不確實(shí)。應(yīng)用 3種噬菌體型金黃色葡萄球菌與α及β毒素組成的疫苗免疫奶牛,結(jié)果表明,該疫苗可以降低奶牛乳房炎發(fā)生率,卻不能提高自愈率,不能提供有效的保護(hù)。

核糖體是一種胞漿顆粒。用核糖體制備菌苗對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染都具有防御作用,可誘導(dǎo)交叉血清型保護(hù),并具有毒性小、效力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),該菌苗已經(jīng)被推廣到生產(chǎn)實(shí)踐中,起到了很好的免疫效果。MASTIVACⅠ是從臨床和亞臨床奶牛乳房炎病例中分離的含有3種血清型金黃色葡萄球菌(VLVL8407,ZO3984和BS449)的滅活苗。LeitneraG等[5]試驗(yàn)證明,這種疫苗對(duì)金黃色葡萄球菌性乳房炎有較強(qiáng)防御作用。Lubashevsy B等[6]采用 452頭荷斯坦奶牛試驗(yàn)證明了 MASTIVACⅠ疫苗能夠非特異性的改善乳腺健康狀況,使產(chǎn)奶量明顯增加。

Wubshet等[7]報(bào)道,含金黃色葡萄球菌纖維素結(jié)合蛋白 (FnBP)的血清對(duì)金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎有調(diào)理作用。Lulzim Shkreta等[8]對(duì)金黃色葡萄球菌 DNA疫苗進(jìn)行了研究,指出了 FnBP和聚集因子 A(Clf A)是葡萄球菌性奶牛乳房炎發(fā)病機(jī)理中的重要蛋白。金黃色葡萄球菌 DNA疫苗是由 FnBP的 D121～34,D320～33和 Clf A的 aa 221 550基因片斷為模板擴(kuò)增的菌體質(zhì)粒 (pC I D 1D 3 I RESClf A)構(gòu)成。另外疫苗中還含有誘導(dǎo)編碼顆粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因(pCI-bGM-CSF)的質(zhì)粒,使機(jī)體的重組細(xì)胞 D 1D3和 Clf A蛋白含量增加,誘導(dǎo)機(jī)體淋巴細(xì)胞的生成,產(chǎn)生抵抗D 1D3和 Clf A的功能性抗體。臨床實(shí)踐證實(shí),此 DNA疫苗對(duì)奶牛金黃色葡萄球菌有很好的保護(hù)性,安全性高[8]。

1.2 金黃色葡萄球菌苗的發(fā)展方向

葡萄球菌細(xì)胞壁上的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,含有多糖和蛋白質(zhì)兩類(lèi)抗原。金黃色葡萄球菌的多糖為抗A型,化學(xué)組成為磷壁酸中的核糖醇?xì)埢?。由于多糖抗原有其特異?所以常用多糖抗原制備疫苗。金黃色葡萄球菌莢膜多糖具有抗吞噬性,是金黃色葡萄球菌的致病因子之一。金黃色葡萄球菌莢膜多糖有特殊的血清型,莢膜產(chǎn)生的抗體有利于白細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)理素細(xì)胞吞噬的殺傷作用,殺傷金黃色葡萄球菌,提高機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌癥的免疫能力。現(xiàn)階段的疫苗研究主要集中于金黃色葡萄球菌莢膜多糖1,2,5,8和336等5種血清型抗原上。其中前 4種抗原的生物學(xué)特性已被證實(shí),336的血清型抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性還不清楚。這 5種血清型抗原的噬菌體是非特異性的,以往幾十年的研究中,在臨床和免疫學(xué)上都沒(méi)有找到特異性的噬菌體。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),血清型 336的抗原不僅出現(xiàn)在無(wú)莢膜葡萄球菌上,而且也出現(xiàn)在血清型 5和血清型 8的菌株中[9]。今后的疫苗研究要著重篩選含有共同抗原的菌株來(lái)制備疫苗,增加疫苗的保護(hù)范圍[6]。

2 大腸桿菌苗

埃希氏大腸桿菌是引起奶牛急性和亞急性乳房炎的主要環(huán)境病原菌,其細(xì)胞壁脂多糖(LPS)由內(nèi)向外分別為菌體Ag層、寡糖層和脂質(zhì)A層。一些粗糙型細(xì)菌核心Ag暴露在外,故能制作菌苗,刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,能殺滅許多革蘭氏陰性菌;由于核心Ag屬于碳水化合物,故免疫期較短。大腸桿菌的主要抗原有 O,K,H等 3種,它們是大腸桿菌血清型鑒定的物質(zhì)基礎(chǔ)。尿道致病性大腸桿菌 (Uropathogenic E.coli UPEC)是常見(jiàn)的牛乳房炎致病菌,它最常見(jiàn)的 O抗原群為O 2,O 8,O 21,O 81和 O 86,毒力因子為 Curli菌毛[10]。

2.1 現(xiàn)有的大腸桿菌疫苗

大腸桿菌疫苗目前研究和使用最多的是E.coli.J-5菌苗。該菌苗是一種缺乏尿苷二磷酸半乳糖異構(gòu)酶的大腸桿菌突變體,不能將外源性半乳糖轉(zhuǎn)移到革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁內(nèi)的葡萄糖上,影響脂多糖的合成,從而造成各種寡糖的缺乏。另外 E.coli.J-5擁有不完全O-多糖,其特征是脂多糖的核心區(qū)和脂質(zhì)A區(qū)抗原是裸露的。裸露的核心抗原刺激抗G-菌核心抗原的 Ig的產(chǎn)生,能保護(hù)多種腸桿菌的感染[11]。

Smith等用大腸桿菌J-5制成疫苗。E.coli.J-5菌苗由 5mL滅活菌體(109/m L)與 5m L弗氏不完全佐劑混合而成,通常采用皮下 3次免疫接種(泌乳末期第 14天,干奶期第 7天,干奶期第 30天)[12]。E.coli.J-5菌苗免疫可提高血清和牛奶中抗 E.coli.J-5核心抗原的抗體效價(jià)。Hogan等[13]認(rèn)為,在干奶期間 E.coli J-5菌苗具有保護(hù)力是由于血清和牛奶中的抗 G-菌體抗原的 IgG和 IgM效價(jià)的升高,從而減輕了細(xì)菌感染的臨床癥狀。并能交叉抵抗其他血清型的E.coli.J的感染,產(chǎn)生其他腸桿菌抗原的抗體。Smith等[12]試驗(yàn)證明,奶牛乳腺內(nèi)免疫后牛奶中 IgG和 IgM效價(jià)比皮下免疫更高,在泌乳 21 d時(shí)乳腺內(nèi)免疫奶牛的血清 IgM效價(jià)高于皮下免疫。雖然乳腺內(nèi)免疫不會(huì)使腸桿菌性乳房炎臨床癥狀減輕,但E.coli.J-5菌苗在 2次皮下注射之間進(jìn)行乳腺內(nèi)免疫比 3次皮下注射免疫產(chǎn)生更高效價(jià)的 IgG和 IgM。Reinhard t等用 1,25-雙羥基 D 3作為佐劑,代替E.coli.J-5菌苗中的弗氏不完全佐劑,發(fā)現(xiàn)血清中 IgM,IgG和 IgA效價(jià)明顯提高,并能有效防止使用弗氏不完全佐劑造成注射部位出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象[14]。Enviracor J-5乳房炎疫苗由法瑪西亞公司生產(chǎn),1993年在美國(guó)使用[15]。現(xiàn)在在美國(guó),防治大腸桿菌型乳房炎疫苗已經(jīng)商品化生產(chǎn),市場(chǎng)上有 3種商品化大腸桿菌乳房炎疫苗,它們的商標(biāo)分別為:J-5Bacterin(J5苗),Mastiguard.TM和Endovac-Bovi。所有大腸桿菌乳房炎疫苗生產(chǎn)中都采用革蘭氏陰性菌 (大腸桿菌)共同核心抗原制造可以防止多種革蘭氏陰性菌的感染。大腸桿菌在乳腺內(nèi)的增殖與乳腺內(nèi)游離的三價(jià)鐵離子的關(guān)系密切,大腸桿菌的生長(zhǎng)和增殖離不開(kāi)三價(jià)鐵離子,最近研究的 E.coli.J5疫苗結(jié)合了檸檬酸三鐵感受因子 A(FecA),增加了疫苗的效果。試驗(yàn)證明,免疫后能夠刺激奶牛機(jī)體免疫球蛋白 G(IgG)的分泌,提高了大腸桿菌性乳房炎的自愈率[16]。

3 鏈球菌疫苗

引起奶牛乳房炎的鏈球菌主要是無(wú)乳鏈球菌(S.aga lactiae)、停乳鏈球菌 (S.dysalactiae)和乳房鏈球菌 (S.uberis),3種菌的形態(tài)相似,直徑為 0.5～1.0μm。3種菌感染的奶牛乳房炎,均不產(chǎn)生明顯的免疫,所以目前也無(wú)可靠的多價(jià)菌

苗[10]。

3.1 現(xiàn)有的鏈球菌疫苗

關(guān)于鏈球菌的疫苗研究的較少,主要是無(wú)乳鏈球菌和乳房鏈球菌,但效果都不理想。使用甲醛滅活后的無(wú)乳鏈球菌對(duì)奶牛無(wú)保護(hù)力;將甲醛滅活的乳房鏈球菌直接注入干奶期奶牛的乳房?jī)?nèi),結(jié)果表明,在產(chǎn)犢后 2個(gè)月牛奶中仍可檢測(cè)到 IgGI和 IgA抗體。Poutrel等指出蛋白 X(一種絕大多數(shù)奶牛鏈球菌乳房炎菌株擁有的蛋白)與 B族鏈球菌莢膜多糖耦聯(lián)組成的疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)理性抗體。FinchM J等利用乳房鏈球菌 0140J活疫苗分別由皮下和乳房灌注的方法對(duì)健康奶牛進(jìn)行免疫,然后分別用乳房鏈球菌 0140J和 C 221攻毒,結(jié)果表明,乳房鏈球菌活疫苗對(duì)同源的病原菌引起的乳房炎有一定的保護(hù)力,但是對(duì)異源的病原菌保護(hù)力較差,特異性強(qiáng),而且指出皮下注射配合乳房?jī)?nèi)灌注的方法能增強(qiáng)疫苗的保護(hù)力。

在 Finch等的試驗(yàn)中,用乳房鏈球菌的滅活苗反復(fù)免疫奶牛,可降低牛奶中的細(xì)菌數(shù)。但不能降低牛奶中的體細(xì)胞數(shù)。Giraudo等的一個(gè)田間試驗(yàn)中采用了乳房鏈球菌和停乳鏈球菌多聯(lián)滅活苗,接種疫苗并不能顯著降低奶牛由鏈球菌引起的乳房炎的發(fā)生。到目前為止還無(wú)有效預(yù)防鏈球菌性乳房炎的商品化疫苗面市。

3.2 鏈球菌苗的研究方向

無(wú)乳鏈球菌是一類(lèi)導(dǎo)致奶牛乳房炎的重要病原菌,可以引起奶牛乳腺?lài)?yán)重的炎癥反應(yīng),Michael等用血纖維蛋白溶酶受體蛋白 (GapC)的基因編碼乳房鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌細(xì)胞表面相關(guān)的 GapC蛋白,但試驗(yàn)證明,GapC的基因工程疫苗免疫后只對(duì)乳房鏈球菌乳房炎有保護(hù)性,而對(duì)無(wú)乳鏈球菌乳房炎無(wú)保護(hù)性,說(shuō)明 GapC基因工程疫苗缺乏種間交叉保護(hù)性[17]。GapC和 αM IgG IgA復(fù)合物蛋白 (Mig),是由無(wú)乳鏈球菌 SDG 8菌株分泌的 2種蛋白,GapC與血纖維蛋白溶酶復(fù)合物蛋白(Plr)有 99.4%相同序列,Mig是位于SDG 8表面的一種蛋白。應(yīng)用 GapC和Mig重組苗免疫奶牛后,檢測(cè)乳汁中體細(xì)胞的含量,兩者都能使乳汁中體細(xì)胞的含量降低,但是 GapC苗能使SDG8含量明顯降低,而 Mig苗卻沒(méi)有降低。此方面的機(jī)理還不很明確,有很大的研究空間[18]。

當(dāng)前,研究微生物和宿主相互作用的技術(shù),已發(fā)展到以基因組為基礎(chǔ)的 cDNA微點(diǎn)陣和蛋白質(zhì)組技術(shù)水平。蛋白質(zhì)組技術(shù)由于其無(wú)轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平的修飾問(wèn)題而比 cDNA微點(diǎn)陣技術(shù)更實(shí)用于對(duì)完全基因組進(jìn)行假定疫苗候選物篩檢。蛋白質(zhì)組技術(shù)包括雙相 (2D)凝膠電泳技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行分離和顯影,以及通過(guò)質(zhì)譜分析 (MS)或 N端氨基酸測(cè)序法對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定。在 2D凝膠中通過(guò)第 1相,使蛋白變性并根據(jù)其電荷量分離,隨后用 SDS處理使所有蛋白帶負(fù)電荷,這樣就可以在第 2相中根據(jù)蛋白質(zhì)量大小進(jìn)行分離。通過(guò) MS或 N端氨基酸測(cè)序法對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定,并與已知病原體的基因組序列進(jìn)行同源性分析。對(duì)每一組分的免疫原性檢測(cè),可用感染過(guò)疾病的宿主血清作探針,對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行 Western blot分析。然而,這些蛋白的生物學(xué)意義和生理功能還需通過(guò)進(jìn)一步分析加以驗(yàn)證[10]。近年來(lái),已通過(guò)采用這種方法對(duì)一些細(xì)菌病原體進(jìn)行了分析。在對(duì)化膿性鏈球菌的研究中,從培養(yǎng)上清中得到了 66個(gè)蛋白斑點(diǎn),從中確認(rèn)了 53條特異序列和 44種不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白中的大部分對(duì)已感染患者的血清均呈現(xiàn)免疫原性,該工作對(duì)化膿性鏈球菌和宿主相互作用在分子水平上提供了新信息。

4 奶牛乳房炎多聯(lián)苗

國(guó)內(nèi)研究的奶牛乳房炎疫苗多是乳房炎多聯(lián)苗。羅金印等在“七五”、“八五”期間,對(duì)我國(guó)進(jìn)行了奶牛乳房炎主要病原菌區(qū)系調(diào)查及其抗原性研究,并初步研制了奶牛乳房炎多聯(lián)苗 A,B,C三種,羅金印等[19]從蘭州、青島、天津、重慶、西安、銀川和西寧等地的病牛乳中分離出的病原菌,經(jīng)培養(yǎng)、生化鑒定,選出生化反應(yīng)典型、毒力強(qiáng)的菌株,通過(guò)免疫原性檢測(cè)菌種為金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌的多聯(lián)苗 (A)。經(jīng)試驗(yàn),選健康泌乳牛 1 652頭,其中注苗組760頭,對(duì)照組 892頭。注射組比對(duì)照組乳房炎發(fā)病率降低 44.195%,具有很好的保護(hù)效果和明顯的臨床免疫效果。我國(guó)蘭州獸醫(yī)研究所研制的奶牛乳房炎多聯(lián)苗(金黃葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌),疫苗經(jīng)后海穴注射比肌注免疫效果提高 23%,注苗后無(wú)乳鏈球菌抗體含量最高,其次為金黃葡萄球菌和停乳鏈球菌,對(duì)鏈球菌引起的乳房炎有一定的免疫作用[20]。國(guó)外也有疫苗配合使用的報(bào)道,Sheik等運(yùn)用 E.coli.J-5疫苗配合改良的都柏林沙門(mén)菌活疫苗來(lái)免疫新生乳牛,對(duì)乳房炎起到了很好的保護(hù)作用[21]。

5 展 望

奶牛乳房炎是由多種非特定的病原微生物引起的乳腺組織炎癥。至今尚未有徹底解決的辦法。在整體上控制奶牛乳房炎的發(fā)生,預(yù)防是重中之重。綜合國(guó)內(nèi)外研究成果及結(jié)合國(guó)內(nèi)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的具體問(wèn)題,奶牛乳房炎的預(yù)防主要是疫苗接種,搞好環(huán)境和牛體衛(wèi)生,采取適當(dāng)?shù)臄D奶衛(wèi)生措施,定期檢查,干奶期治療所有的乳區(qū),加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,增強(qiáng)奶牛體質(zhì),減少外傷因素,防止其他疾病的繼發(fā)等[22]。奶牛乳房炎疫苗的研制和開(kāi)發(fā)對(duì)奶牛乳房炎的防治有著廣闊的前景。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)