蛋白質(zhì)間相互作用的研究策略

李志群 祝 楊 李培建

對(duì)于一種新基因，同時(shí)把其編碼的新蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能、生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)之間的相互關(guān)系、以及新基因表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制闡明，是目前基因的分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最具挑戰(zhàn)性的工作。首先利用酵母雙雜交（yeast two-hybrid）技術(shù)、酵母單雜交技術(shù)（yeast one-hybrid）、抑制性消減雜交（SSH，suppression subtractive hybridization）技術(shù)、基因芯片（DNA chip）技術(shù)、噬菌體表面展示（phage display）技術(shù)等獲得蛋白結(jié)合蛋白的編碼基因、差異表達(dá)的基因、DNA/RNA結(jié)合的蛋白基因等，或利用生物信息學(xué)技術(shù)獲得推測(cè)的編碼基因。然后，利用分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合的手段，闡明新基因的功能、基因表達(dá)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制基礎(chǔ)，最終闡明新基因的結(jié)構(gòu)和新蛋白的生物學(xué)功能，以及這種基因研究的可能臨床醫(yī)學(xué)意義。生物信息學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，是目前基因的分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要、有效的研究技術(shù)和方法[1，2]。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的意義

蛋白質(zhì)組（proteome）最早見諸于1995年7月的“Electrophoresis”雜志上[3]，它是指一個(gè)有機(jī)體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)方式。蛋白質(zhì)組研究雖然尚處于初始階段，但已經(jīng)取得了一些重要進(jìn)展。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要內(nèi)容是，在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時(shí)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。對(duì)蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個(gè)方面。一方面，通過二維凝膠電泳得到正常生理?xiàng)l件下的機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜，相關(guān)數(shù)據(jù)將作為待檢測(cè)機(jī)體、組織或細(xì)胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫。一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。二維參考圖譜建立的意義在于為進(jìn)一步的分析工作提供基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組分析的另一方面，是比較分析在變化了的生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化[4]。如蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，翻譯后修飾的變化，或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上的定位的改變等。研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。通過分析一個(gè)蛋白質(zhì)是否跟功能已知的蛋白質(zhì)相互作用可得到揭示其功能的線索。因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)告訴我們，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用，那么它們一般參與相同或相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)[4]。從近期國(guó)際上蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展動(dòng)向可以看出，揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，建立相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖，已成為揭示蛋白質(zhì)組復(fù)雜體系與蛋白質(zhì)功能模式的先導(dǎo)，業(yè)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展

酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）自建立以來已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)有力的方法之一。該方法在不斷完善，如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗(yàn)蛋白質(zhì)間的相互作用，而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)，在對(duì)蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)上發(fā)揮了重要的作用。

雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，簡(jiǎn)稱為DB）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，簡(jiǎn)稱為AD），它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄[5]。

Fields等人的工作標(biāo)志雙雜交系統(tǒng)的正式建立[6]。他們以與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合，另外一個(gè)與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”（bait）和“獵物”或靶蛋白（prey or target protein）。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用，那么分別位于這兩個(gè)融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這個(gè)被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報(bào)道基因（reporter gene）。通過對(duì)報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報(bào)道基因，并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個(gè)改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因（Gal80是Gal4的負(fù)調(diào)控因子）被缺失，從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達(dá)載體的酵母細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性，單獨(dú)轉(zhuǎn)化其中任何一個(gè)載體都不能檢測(cè)出β-半乳糖苷酶活性。

在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和α接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細(xì)胞之間或α接合型細(xì)胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點(diǎn)，他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細(xì)胞，“誘餌”表達(dá)載體轉(zhuǎn)化a接合型細(xì)胞。然后分別鋪篩選平板使細(xì)胞長(zhǎng)成菌苔（lawn），再將兩種菌苔復(fù)印到同一個(gè)三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細(xì)胞才能在此平板上生長(zhǎng)。單倍體細(xì)胞或雖然是二倍體細(xì)胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長(zhǎng)出來的克隆進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活力進(jìn)行鑒定[7]。

三、生物信息學(xué)技術(shù)與新基因的研究

新基因的克隆化無異是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域創(chuàng)新知識(shí)源泉的重要組成部分。這一任務(wù)，不僅是人類基因組計(jì)劃（HGP）的核心內(nèi)容，同時(shí)也是后基因組計(jì)劃（post-HGP）的重要內(nèi)容.多年來，隨著以人的基因克隆化為主的不同生物類型基因克隆化研究的進(jìn)展，已然積累了大量的不同生物的基因序列、蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列，同時(shí)對(duì)于不同生物種屬之間基因序列、蛋白質(zhì)以及結(jié)構(gòu)序列的保守結(jié)構(gòu)位點(diǎn)也積累了豐富的資料，并據(jù)此建立了龐大的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)。對(duì)于這些數(shù)據(jù)的分析，必須依靠計(jì)算機(jī)分析技術(shù)。計(jì)算機(jī)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，為這些資料和數(shù)據(jù)的分析建立了一些有效的分析技術(shù)。因此，自然而然就將基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的資料與計(jì)算機(jī)分析技術(shù)結(jié)合起來，形成了目前極具潛力的新興交叉學(xué)科-生物信息學(xué)（bioinformatics）技術(shù)。生物信息學(xué)技術(shù)的形成和發(fā)展，大大促進(jìn)了以基因的分子生物學(xué)為核心內(nèi)容的現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以基因的分子生物學(xué)為核心內(nèi)容的理論和技術(shù)，已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的創(chuàng)新知識(shí)源泉[8]。

四、生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

隨著后基因組時(shí)代的到來，闡明基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律和生物功能，即蛋白質(zhì)組的研究，成為我們研究的最終目的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)才是生命活動(dòng)的真正執(zhí)行者[9]?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)研究方法，如雙向電泳等電聚焦、色譜分析、質(zhì)譜分析等，都需要特殊設(shè)備且價(jià)格昂貴；體外翻譯表達(dá)系統(tǒng)可研究蛋白質(zhì)的加工、釋放和亞細(xì)胞定位，但操作繁瑣，而生物信息學(xué)為我們提供了一條可以直接由基因或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)分析的捷徑。

生物信息學(xué)（bioinformatics）是生物與計(jì)算機(jī)科學(xué)以及應(yīng)用數(shù)學(xué)學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。它通過對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析，達(dá)到解釋數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的。

由于基因組和蛋白質(zhì)組研究提供了極為豐富的數(shù)據(jù)，因而需要我們對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行高度自動(dòng)化管理，建立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)庫并編寫相應(yīng)的軟件，這項(xiàng)工作本身也極大地推動(dòng)了生物信息學(xué)的發(fā)展，而生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)的研究中將發(fā)揮特殊作用[10]。下面將介紹生物信息學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)分析中的作用。

五、生物信息學(xué)發(fā)展趨勢(shì)

生物信息學(xué)內(nèi)涵非常豐富的學(xué)科，其核心是基因組信息學(xué)，包括基因組信息的獲取、處理、存儲(chǔ)、分配和解釋。它研究的是揭示基因組信息結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語言的根本規(guī)律，解釋生命的遺傳語言。生物信息學(xué)已成為整個(gè)生命科學(xué)發(fā)展的重要組成部分，成為生命科學(xué)研究的前沿。隨著人類基因組計(jì)劃（Human Genomic Project，HGP）的完成和功能基因組計(jì)劃的實(shí)施，積累了大量的關(guān)于核苷酸、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，人們的注意力和工作重點(diǎn)已從基因組測(cè)序轉(zhuǎn)向?qū)蚪M表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)和分析。為了解釋和理解這樣大量的數(shù)據(jù)，自然地引進(jìn)了信息科學(xué)與技術(shù)、物理、數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)學(xué)科的理論與技術(shù)，從而出現(xiàn)了生物信息學(xué)這一嶄新的交叉學(xué)科。雖然獨(dú)立的生物信息學(xué)技術(shù)在世界各地廣泛運(yùn)用，并已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)，但各種核苷酸和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的建立，以及因特網(wǎng)的聯(lián)系與數(shù)據(jù)庫資料的共享，代表了生物信息學(xué)的主流內(nèi)容和工具。生物信息學(xué)的逐漸形成和發(fā)展，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科都產(chǎn)生了革命性的影響[8，11～15]。

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