殼寡糖分析檢測的研究進展

王 禮 鄧衛(wèi)利 林文業(yè)

(廣西分析測試研究中心，廣西 南寧 530022)

殼寡糖分析檢測的研究進展

王 禮 鄧衛(wèi)利 林文業(yè)

(廣西分析測試研究中心，廣西 南寧 530022)

殼寡糖是殼聚糖降解后產(chǎn)生的一類可溶于水的氨基糖類化合物，聚合度一般在2～10之間，文中對殼寡糖分析檢測方法進行了綜述，主要包括比色法，色譜法，質(zhì)譜法，電泳法等。

殼寡糖；比色法；色譜法；質(zhì)譜法；電泳法

（一）引言

功能性低聚糖是由2～10個相同或不同的單糖以糖苷鍵聚合而成，具有糖類某些共同的特性，但不會被胃酸等降解，不在小腸吸收直接到達大腸，具有促進人體雙歧桿菌的增殖等生理功能，所以功能性低聚糖又被稱為雙歧因子。

殼寡糖（chitooligosaccharide，COS）又稱低聚葡萄糖胺，低聚氨基葡萄糖等，是功能性低聚糖的一種，是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，聚合度一般在2～10之間，是目前自然界中僅知的唯一的堿性寡糖，具有獨特的生物活性，如抗菌抑菌；極強的吸濕保濕性；抑制腫瘤細胞（聚合度為6～8時活性最高）；誘發(fā)植物的誘導抗病性等，使其在食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)等方面有廣闊的發(fā)展前景。不同分子量的殼寡糖，其生物活性差異很大。近年來，殼寡糖的功能研究取得了長足的進步，同時也對殼寡糖的分析測定提出了挑戰(zhàn)。文章主要介紹了近10年內(nèi)殼寡糖的分析測定方法的研究進展。

（二）殼寡糖的分析測定方法研究進展

1.比色法

在初步分析殼寡糖時多采用比色法。鄔建敏通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色，確定了甲殼低聚糖平均聚合度及平均相對分子質(zhì)量。劉琳等利用分光光度法測定殼寡糖平均聚合度，此方法經(jīng)凝膠滲透色譜驗證，能較為準確地判斷殼寡糖的平均聚合度。雖然比色法技術(shù)簡單，對設(shè)備要求不高，成本較低，但由于其準確性不高，因此有必要開發(fā)一種新的可準確測定殼寡糖的分析方法。

2.色譜法

（1）薄層色譜法

薄層色譜法是在紙層析法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分辨效率高，分離效果好，簡便易行，重現(xiàn)性好，在同一塊薄板上可同時分析多個樣品。孟顯麗，陳國華等通過實驗建立了薄層色譜（TLC）分析殼寡糖的條件即最佳的展開劑是乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水= 5∶5∶4∶0.3，樣品上行展距為8cm，采用浸漬法顯色。陳小娥，方旭波等通過系統(tǒng)研究，建立了殼低聚糖的薄層-比色分析法，展開劑為正丁醇∶水∶乙酸∶氨水=20∶10∶10∶2；展開溫度為25℃，為殼低聚糖的生產(chǎn)和應用提供了一種經(jīng)濟、簡便的分析方法。王曉燕，許牡丹等建立的殼低聚糖的薄層比色分析方法是展開劑為乙酸乙酯∶無水乙醇∶水∶氨水= 5∶5∶4∶0.45，采用苯胺-二苯胺-磷酸顯色，點樣量為2μg/μL，可分開單糖至低聚七糖各組分，斑點圓形、清晰、無拖尾，分離效果好。

薄層層析法雖然可以分析殼寡糖，價格低廉，但此方法操作時間長，只能進行微量生產(chǎn)，無法定量，薄層-比色法可用于殼寡糖常規(guī)檢驗。但是，要大規(guī)模地對殼寡糖分離分析還需要不斷地尋求新的技術(shù)。

（2）高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色譜法（HPLC）是定量分析低聚糖類及其他糖類最常用的方法，具有方便、快速、分離效果好、分辨率高、重現(xiàn)性好和不破壞樣品等優(yōu)點，該方法必須有標準品作參照。由于糖類物質(zhì)在紫外光區(qū)間沒有吸收，故無法使用紫外檢測器，早期多采用示差檢測器來檢測糖類物質(zhì)，但是示差檢測器無法進行梯度洗脫，所以檢測的聚合度多在8以下，現(xiàn)在多采用蒸發(fā)光散射檢測器或電化學檢測器（脈沖安培檢測器），分離柱常用氨基柱或陰離子交換柱。紀瑩等通過HPLC法分析檢測殼寡糖組分，用TSK-Gel Amide-80柱，示差檢測器檢測，流動相為乙腈∶水= 37∶63，pH為4.0，柱溫為25℃，上樣量1μL。李曙光等用Shodex NH2p-50 4E氨基柱，蒸發(fā)光散射檢測器，使殼寡糖按照聚合度順序依次被洗脫，檢測到的殼寡糖的聚合度范圍可達15糖。楊菊林等通過HPLC對不同脫乙酰度的殼聚糖底物經(jīng)殼聚糖酶酶解后得到的殼寡糖進行分析，條件是：KS2801柱，洗脫液0.001mol/L含0.02%(質(zhì)量分數(shù))NaN3的NaOH，流速0.5mL/min，柱溫40℃，殼寡糖質(zhì)量分數(shù)0.05%，上樣量20μL。

陰離子交換柱和電化學檢測器配合使用也是殼寡糖檢測的一種常用方法，該方法靈敏度高，樣品用量少，但儀器昂貴，操作條件比較嚴格。劉慶生等[11]通過高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(HPAEC-PAD)聯(lián)合使用，直接進行檢測低濃度殼寡糖的定量分析，分析了聚合度為1-6的殼寡糖，并且得到清晰的分離峰。這種方法不需要預先衍生就能分析殼寡糖，不僅節(jié)約了大量的時間和金錢，而且避免了一些有毒的衍生試劑的使用，減少了環(huán)境污染，在組成結(jié)構(gòu)大小上非常相近的單糖也可得到很好的分離，且靈敏度很高，檢測限量可達到幾十個pg/L水平。

高效液相色譜法雖然效果好，但是它需要大型的儀器，流動相和標準品花費昂貴，對于一般的實驗室來說，初期篩選不宜使用高效液相色譜法。

（3）氣相色譜（GC）

氣相色譜法檢測殼寡糖的文獻相對較少，朱曉蘭，夏文水等采用毛細管氣相色譜法（cGC）測定了D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(GAH)，測定結(jié)果較比色法準確，但分析步驟比較多且對設(shè)備要求較高。

（4）凝膠滲透色譜(GPC)

凝膠滲透色譜法是利用流動相與控制孔徑分布的固定相接觸從而使溶質(zhì)按分子體積大小分離的色譜方法。1964年，Moore首先發(fā)表了使用GPC方法來測量高聚物的分子量分布，該方法速度快、重復性好。利用GPC數(shù)據(jù)還可以計算Mw、Mn 和Mz 等平均分子量。這些優(yōu)點使GPC成為測定分子量分布的主要方法。GPC 測定殼寡糖的分子量可以認為是一個相對值。如果將光散射法與GPC法聯(lián)用( GPC-LLC)，即可以將相對方法轉(zhuǎn)化為絕對方法。那么，制定易行的可參照的分子量及分子量分布的測定和計算方法是殼寡糖研究領(lǐng)域的一個重要問題。

覃彩芹等用凝膠滲透色譜測定了殼聚糖的降解產(chǎn)物即殼寡糖的分子量，后用凝膠滲透色譜(GPC)和碳-13核磁共振譜(13C-NMR)分析表征甲殼低聚糖。劉羿君等用凝膠滲透色譜法研究了殼聚糖水解過程中的分子量及其分布，制備了不同低分子量的殼聚糖和殼寡糖。

3.質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法是檢測殼寡糖聚合度最有效的方法，可以利用時間飛行質(zhì)譜（TOF-MS）直接測定殼寡糖的分子量，同時測定殼寡糖是否帶有N-乙?；?，也可以利用基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析殼寡糖，只是設(shè)備的價格限制的質(zhì)譜分析方法的使用。邵健等在中性條件下采用過氧化氫溶液對殼聚糖進行氧化降解，制備了分子量為l000左右的藥用殼寡糖，并用傅立葉變換質(zhì)譜儀分析表征了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。李艾華等[21]用Nicolet FT-IR 360 紅外光譜儀記錄紅外光譜，基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析殼寡糖，得到了聚合度3-6的甲殼寡糖。M.Mengíbar等通過MALDI-TOF-MS對殼聚糖降解產(chǎn)物的分析得出殼聚糖酶的作用位點，進而推理殼寡糖的結(jié)構(gòu)。陳勉，朱希強等利用MALDI-TOF-MS方法可以直接檢測到殼寡糖的精細結(jié)構(gòu)，聚合度，乙?；臄?shù)量及其剖面圖，從而鑒定殼寡糖的質(zhì)量，為其從健康食品朝病人所需的藥品方向發(fā)展做出了貢獻。

4.電泳法(Electrophoresis)

用電泳法分析殼寡糖的報道不多，采用這種方法難于實現(xiàn)較大規(guī)模的分離純化，它僅僅為我們提供了一條新的思路。20世紀90年代，國外一些科學家通過熒光輔助毛細管電泳法來分析殼寡糖，國內(nèi)的李邦良等用高效毛細管電泳測定了寡糖的聚合度。王亮等用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分析檢測殼寡糖組成，能夠簡單快速有效地定性檢測殼寡糖，獲得了最佳殼寡糖分析圖譜。

（三）展望

隨著各種分析技術(shù)在殼寡糖的分析測定中的應用，殼寡糖工業(yè)不斷發(fā)展，但還面臨著很多理論和實際問題。目前大部分的應用還只處于實驗室階段，而真正可以用于實際樣品測定的方法和體系并不多，進一步提高分析的準確性和靈敏度仍是重要的研究課題。總之，盡管殼寡糖的研究面臨著重重困難與挑戰(zhàn)，但因其發(fā)展前景廣闊，吸引了越來越多的科研工作者的參與，并且隨著各種檢測技術(shù)的不斷進步，其它領(lǐng)域（如納米科學、超分子科學等）的發(fā)展，也必將為殼寡糖的發(fā)展帶來更多的契機。

[1] Margarete Spindler-Barth，Ulrich Buss.ELISA for determination of chitin and chitosan[M]. R.A.A.Muzzarelli,M.G.Peter.Chitin Handbook,Lyon: European Chitin Society,1997．

[2] 夏文水,劉夏忠,張帆.氨基葡萄糖鹽酸鹽穩(wěn)定性及其制備的研究[J].無錫輕工大學學報,1997,16(4):29-23.

[3] 鄔建敏.光度法測定甲殼低聚糖的平均相對分子質(zhì)量[J].化學世界,2001(6).

[4] 劉琳,張杰,李鵬,等.分光光度法測定殼寡糖平均聚合度的研究[J].食品科技,2010,35(9).

[5] 孟顯麗,陳國華,孫明昆,等.薄層色譜法分析殼寡糖[J].青島海洋大學學報,2002,32(4):641-644.

TQ917

A

1008-1151(2011)05-0109-02

2011-02-25

廣西區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項項目（2009ACZ09）

王禮（1964－），女，供職于廣西分析測試研究中心，從事分析測試的數(shù)據(jù)統(tǒng)計工作。