艾草白粉病的病原菌鑒定

張菊??+張怡??+曹鵬??+安一博??+黃輝??+袁俊慧??+王瑞瑞??李成偉

摘要：為了研究周口地區(qū)出現(xiàn)的艾草白粉病菌的種類和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其防治及系統(tǒng)進(jìn)化提供理論依據(jù)，采用顯微形態(tài)學(xué)觀察、致病性檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。結(jié)果表明，艾草白粉病菌分生孢子長(zhǎng)度平均約為34.57 μm，寬度平均約為18.36 μm，以約3～8個(gè)分生孢子串生在分生孢子梗上，附著胞少裂片對(duì)生。根據(jù)病原菌的rDNA-ITS序列（GenBank登錄號(hào)為KF056818）建立進(jìn)化樹分析可知其與來(lái)自韓國(guó)、日本的Golovinomyces artemisiae聚在1支上，登錄號(hào)分別為KJ136112、AB077654，而與同屬的另外1個(gè)種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分析認(rèn)為，河南周口地區(qū)的艾草白粉病菌為G. artemisiae。

關(guān)鍵詞：艾草白粉病菌；分子鑒定；進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)： S435.672文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0178-03

艾草（Atemisia argyi）別稱艾蒿，屬菊科（Asteraceae）蒿屬（Artemisia）植物，全草入藥，具有溫經(jīng)、去濕、平喘、利膽、止血、消炎、抗過(guò)敏等作用，故藥物學(xué)家李時(shí)珍對(duì)艾草推崇有加，并記錄在《本草綱目》中。目前，白粉病是艾草的主要病害，葉片、葉柄及莖危害較重，病部生有或薄或厚的白色無(wú)定形斑片，嚴(yán)重時(shí)可致整個(gè)植株死亡。雖然化學(xué)農(nóng)藥對(duì)白粉病的防治有一定的作用，但長(zhǎng)期使用農(nóng)藥可能會(huì)造成農(nóng)藥殘留并影響艾草本身的藥性，因此難以保證艾草的藥用品質(zhì)。已有學(xué)者對(duì)艾草白粉病[1-3]進(jìn)行過(guò)研究，在青島、甘肅、塔里木盆地等的艾草植株上出現(xiàn)蒿白粉病菌，但僅限于對(duì)其形態(tài)學(xué)的研究，至今未發(fā)現(xiàn)運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)艾草白粉病菌進(jìn)行研究的報(bào)道。因此，針對(duì)在河南周口發(fā)現(xiàn)的艾草白粉病菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、致病性、分子生物學(xué)的研究，以期為艾草白粉病菌系統(tǒng)進(jìn)化及防治奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

感染白粉病菌的艾草植株取自周口師范學(xué)院校園內(nèi)。

1.2白粉病菌的形態(tài)觀察

[CM（24]首先采取感病葉片，通過(guò)二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diamino[CM）]〖LM〗benzidine tetrahydrochloride，DAB）和臺(tái)盼藍(lán)染色后在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察[4]。同時(shí)剪取1 cm×1 cm大小的感病葉片，經(jīng)真空鍍金后，在Quanta 200型掃描電子顯微鏡的高真空環(huán)境下進(jìn)行觀察。參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)設(shè)駐留時(shí)間為6 μs，燈絲電壓為25.00 kV。

1.3白粉病菌總DNA的提取、ITS序列的克隆及測(cè)序

1.3.1病原菌總DNA的提取總DNA的提取方法參考生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒。

1.3.2ITS序列的克隆及測(cè)序ITS序列采用真菌核糖體區(qū)段通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。白粉病菌ITS PCR擴(kuò)增體系為20 μL：總DNA模板1 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，ddH2O 5 μL，Taq Mix 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將所得到的目的條帶經(jīng)膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]純化，連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)質(zhì)粒PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌株后，將其送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜素與艾草白粉病菌ITS序列高度同源的序列，下載不同地區(qū)的G. artemisiae ITS序列，采用Clustal X（1.83版）進(jìn)行序列的完全比對(duì)，利用MEGA5.0軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining，N-J）生成艾草白粉病菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹，用自展法對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行檢驗(yàn)，自展數(shù)為1 000次。

2結(jié)果與分析

2.1白粉病菌的形態(tài)觀察

[JP3]艾草白粉病菌主要侵染葉片正面，也可侵染葉片背面，發(fā)病初期葉片表面出現(xiàn)白色無(wú)定形斑片，隨后逐漸擴(kuò)大并連成片狀白粉斑，即為病原菌分生孢子、分生孢子梗和菌絲體。病菌嚴(yán)重時(shí)，白粉斑布滿整個(gè)葉片，更為嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整個(gè)植株死亡。

將感病葉片經(jīng)真空鍍金后在掃描電鏡下進(jìn)行觀察，同時(shí)采用DAB和臺(tái)盼藍(lán)對(duì)其染色，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，艾草白粉病菌的分生孢子成串且呈橢圓形或柱形，單個(gè)分生孢子長(zhǎng)度平均約為34.57 μm，寬度平均約為18.36 μm，以約為3～8個(gè)分生孢子串生在分生孢子梗上，附著胞少裂片對(duì)生（圖1）。

2.2病原菌的致病性鑒定

根據(jù)科赫氏法則，對(duì)病原菌進(jìn)行致病性檢測(cè)，收集感病植株上的白粉病菌接種至健康的艾草植株上，15 d后葉片出現(xiàn)白色的粉狀物，且與自然狀態(tài)發(fā)病葉片上的癥狀類似（圖2-A）。取發(fā)病艾草葉片染色后在顯微鏡下觀察，其特征與自然發(fā)病葉片的顯微形態(tài)觀察特征相同（圖2-B），因此初步鑒定此病原菌為G. artemisiae。

2.3ITS序列的擴(kuò)增及分析

本試驗(yàn)通過(guò)真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4，以艾草白粉病菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增艾草白粉病菌核糖體的ITS區(qū)，經(jīng)38個(gè)循環(huán)后得到553 bp的目的片段（圖3）。將ITS序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到艾草白粉病

菌ITS序列的登錄號(hào)為KF056818。在NCBI中進(jìn)行BLAST，與其他同源序列比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，周口地區(qū)艾草白粉病病原菌ITS區(qū)段核苷酸編碼序列中，1～178位為ITS1區(qū)段序列，179～331位為5.8S rDNA全序列，332～493位為ITS2區(qū)段序列，494～553位為28S rDNA序列。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)艾草白粉病菌G. artemisiae進(jìn)行BLASTn同源序列搜索，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)目的序列KF056818與來(lái)自韓國(guó)的青蒿（登錄號(hào)KJ136112）、日本的杭白菊（登錄號(hào)AB077654）的白粉病菌親緣關(guān)系最近，聚在1個(gè)進(jìn)化支上；同時(shí)與來(lái)自美國(guó)艾草和日本魁蒿、山地蒿、濱菊上的白粉病菌（登錄號(hào)分別為AB077659、AB077649、AB769433）均達(dá)到99%同源，而與來(lái)自阿根廷茜草科蓬子菜上的G. riedlianus（登錄號(hào)AB769420）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性僅為93%（圖4）。

3討論

據(jù)報(bào)道，艾草葉片中含有天然藥物活性成分，加工的艾葉具有血管舒張[5]、抑制血小板聚集[6]、抗誘變、抗真菌活性、抗灰霉病等作用[7]。另外，蒿類植物中的黃酮提取物已被證實(shí)有抗炎、抗氧化、抗菌等多種功效[8]。在藥用植物的生產(chǎn)過(guò)程中，病蟲害問題已日漸突出，因此掌握藥用植物病害的種類及危害情況對(duì)于開展防治及深入研究具有極其重要的意義。

在真菌的鑒定過(guò)程中，通常采用形態(tài)學(xué)方法，通過(guò)觀察真菌的形態(tài)大小、形狀來(lái)進(jìn)行分類，但此法往往受人為、環(huán)境因素影響導(dǎo)致不能準(zhǔn)確判斷物種之間的進(jìn)化關(guān)系[9]。真菌 rDNA-ITS 序列在進(jìn)化過(guò)程中保守性較強(qiáng)，有助于各種族之間親緣關(guān)系的確定。但更多學(xué)者認(rèn)為，rDNA-ITS序列分析雖有優(yōu)點(diǎn)，但并不能單獨(dú)以這種方法鑒定出所有真菌種類，宜采用與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法鑒定真菌種類[10]。

本研究利用rDNA-ITS序列在真菌鑒定上的應(yīng)用，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可得，周口地區(qū)的艾草白粉病菌與韓國(guó)青蒿（KJ136112）、日本杭白菊（AB077654）的白粉病菌同源性均達(dá)到99%，但艾草白粉病菌卻未能與其寄主為同一屬的青蒿聚在同一支，來(lái)自日本寄主為魁蒿（AB077659）、山地蒿（AB077649）和立陶宛的中亞苦蒿（AB769430）均為蒿屬的不同小種，卻未能聚在1支，不同屬的青蒿、杭白菊卻聚在同一支，因此推測(cè)白粉病菌進(jìn)化與自身小種進(jìn)化有關(guān)。然而劉先寶等學(xué)者對(duì)海南的野艾蒿白粉病菌進(jìn)行rDNA-ITS序列鑒定認(rèn)為，其與菊科黃瓜菜的叉絲單囊殼白粉菌高度同源[11]，這與本研究結(jié)果有一定的差異。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，白粉病菌雖具有?；訹12-14]，但不一定只侵染某一種特定的植物，如番茄白粉病菌可侵染除茄科以外的葫蘆科的部分植物[15-16]，同時(shí)地域差異也可能造成白粉病菌的變異。

本研究運(yùn)用顯微形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)河南周口地區(qū)艾草白粉病菌進(jìn)行分析鑒定，對(duì)河南省艾草白粉病病菌的分類及防治艾草白粉病具有重要的意義。

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