ABCA1基因R219K多態(tài)性與寧夏回、漢族腦梗死患者及血脂的關(guān)系

楊 平， 顧淑娥， 張麗芳， 杜彥輝

三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)可以通過影響血脂水平、保護(hù)血管內(nèi)皮、介入炎性反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的過程，減輕動(dòng)脈粥樣硬化的程度［1］。ABCA1基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)含有大量的SNP位點(diǎn)，研究表明這些SNP位點(diǎn)與血漿脂質(zhì)水平以及動(dòng)脈硬化程度有密切的相關(guān)性，而腦梗死患者大部分都伴有動(dòng)脈粥樣硬化。國(guó)內(nèi)的研究對(duì)象大部分是不同區(qū)域的漢族人群，本研究探討回、漢族在腦梗死患者ABCA1的R219K多態(tài)性的分布的差異及其與血脂的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

入選2008年1月～2010年5月寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的腦梗死住院患者266例，漢族患者(漢族腦梗死組)185例，平均年齡63.1±15.8歲，男性116例，女性69例;回族患者(回族腦梗死組)81例，平均年齡60.6±12.7歲，男性52例，女性29例。并登記患者的基本情況(既往史、BMI指數(shù)等)。腦梗死組患者入選標(biāo)準(zhǔn):(1)腦梗死診斷符合全國(guó)第四屆腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實(shí);(3)同意提供血標(biāo)本;(4)患者或家屬同意簽署“知情同意書”。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)腔隙性腦梗死、腦出血、腦栓塞、蛛網(wǎng)膜下腔出血;(2)繼發(fā)性腦血管病患者，如外傷、血液病、炎癥等引起者;(3)靜脈系統(tǒng)血栓形成;(4)惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全者(5)不同意提供血標(biāo)本;(6)患者或家屬不同意簽署“知情同意書”。

1.2 方法

1.2.1 血脂檢測(cè) 收集回、漢族腦梗死患者空腹12h血標(biāo)本5ml，室溫2～3h后3000r/min離心10min，-20℃保存血清和血漿，測(cè)定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，由我院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。

1.2.2 R219K多態(tài)性檢測(cè) DNA提取采用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒?；蛐痛_定采用PCR-RFLP法，PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，PCP引物由上海生工生物工程有限公司合成，R219K上游 引 物:5’-GCAAGGCTACCAGTTACATTTG ACAAG-3’;下游引物:5’-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGG-3’。50μl PCR 反應(yīng)體系，其中DNA 模板 0.5 μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1 μl，2 × EasyTaq PCR Super Mix 25μl，ddH2O 22.5μl。R219K 擴(kuò)增條件:首先 94℃預(yù)變性5min 后 94℃ 變性 1min、53℃ 退火 30s、72℃ 延伸40s，共32個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 10min，4℃保存。用Primer 5.0檢索的Eco130I作為R219K的限制性內(nèi)切酶，酶切反應(yīng)體系 20μl:PCR產(chǎn)物 10μl，Eco130I(Fermentas公司生產(chǎn))1μl，10 × Eco130I緩沖液(含 BSA)2μl，ddH2O7μl。37℃酶切8h，65℃滅活20min，3%瓊脂糖150V電壓電泳30min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

遺傳平衡檢驗(yàn)用 HEW1.0軟件，數(shù)據(jù)處理用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件;基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher的確切概率法，多組之間率的比較采用χ2分割法，多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)兩組血脂水平的影響采用方差分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基本情況比較

兩組間在年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(見表1)。

表1 各組基本情況的比較

2.2 ABCA1基因R219K酶切結(jié)果

Eco130I酶切后出現(xiàn)3種片段組合(見圖1):RR為 166 bp;RK 為 166 bp、101 bp、65 bp;KK 為101bp、65 bp。

2.3 Hardy-Weinberg平衡

R219K在回、漢腦梗死組基因型的觀察值與期望值檢測(cè)符合Hardy-Weinberg平衡(見表2)。

2.4 兩組ABCA1基因R219K多態(tài)基因型與等位基因頻率的比較

見表3。兩組等位基因頻率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.008，P=0.315);兩組間基因型頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.647，P=0.022)，與 RK 型比較，回族腦梗死組KK基因型較較漢族腦梗死組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.657，P=0.006);而將回、族腦梗死患者的性別、年齡(≥60歲)、高血壓病、糖尿病進(jìn)行亞組分析后結(jié)果顯示，僅回族男性(χ2=6.725，P=0.010)和伴有高血壓(χ2=7.127，P=0.008)的腦梗死患者KK型較漢族腦梗死組低，而年齡和糖尿病在兩組組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.5 3種基因型與血脂的關(guān)系

見表4。RR型TG、TC較高，而HDL-C較低，KK型HDL-C較高，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

圖1 ABCA1的PCR產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果

表2 兩組Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)

表3 兩組ABCA1基因R219K多態(tài)基因型與等位基因頻率的比較

表4 ABCA1基因的R219K多態(tài)各基因型間血脂水平的比較(mmol/L)

3 討論

ABCA1基因位于常染色體9q31上，約150kb，包含50個(gè)外顯子和49個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1453kb是啟動(dòng)子區(qū)，有多個(gè)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。它所編碼的蛋白稱為ABCA1蛋白，是一種跨膜糖蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為2.2×105，含有2261個(gè)氨基酸，在結(jié)構(gòu)上ABCA1由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體被確定為在ATP結(jié)合域的存在基礎(chǔ)上而發(fā)揮作用，其中含有3個(gè)具有特征性的保守區(qū)域［2］。ABCA1基因至少50個(gè)突變已被確認(rèn)。其中包括23個(gè)錯(cuò)義突變，6個(gè)無義突變，21個(gè)插入或缺失。49個(gè)突變發(fā)生在外顯子，所有的突變都可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的流出降低［3］。R219K多態(tài)性作為被公認(rèn)為是抗動(dòng)脈粥樣硬化的多態(tài)，與HDL-C增高，甘油三酯水平的降低有關(guān)［4］。ABCA1基因突變可導(dǎo)致Tangier病(TD)和家族性低α脂蛋白血癥(FHA)，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的HDL、apoA1低下、早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、伴有肝脾腫大和外周神經(jīng)病變等［5］。由于ABCA1促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的TC和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至HDL-C前體載脂蛋白A1，因此該蛋白在逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起第一步限速作用，啟動(dòng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程，防止早期動(dòng)脈硬化［6］。

R219K多態(tài)為第7號(hào)外顯子 ABCA1基因第1051位核苷酸發(fā)生G堿基替換成A堿基，導(dǎo)致精氨酸(Arg)-賴氨酸(Lys)替代。該多態(tài)與冠心病關(guān)系密切，研究也較多。Clee等［7］研究表明攜帶K等位基因者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)降低，K等位基因是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立保護(hù)因素，首次發(fā)現(xiàn)R219K有減少冠心病事件及冠狀動(dòng)脈病變程度的作用。國(guó)外有研究表明［8］，不同人種ABCA1基因 R219K等位基因變異頻率不同，美國(guó)黑人(59.5%)明顯高于白人(26.2%)，KK+RK 攜帶者，黑人為 83.3%，而白人為44.2%。可能R219K基因型的表達(dá)受遺傳、環(huán)境因素等影響，不同種族之間存在差異。在伊朗人群中，RR型增加患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，且是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［9］。最近的一項(xiàng)Meta分析研究也顯示攜帶等位基因K患冠心病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，K等位基因在亞洲人和高加索人中都是冠心病的保護(hù)因素。KK型較RR型的HDL-C水平高，但按種族分組分析后僅僅是在亞洲人KK型與高水平HDL-C相關(guān)［10］。

國(guó)內(nèi)外研究關(guān)于ABCA1與腦梗死的關(guān)系很少報(bào)道，關(guān)于R219K多態(tài)性與腦梗死和血脂水平的關(guān)系目前還存在爭(zhēng)議，Andrikovics等［11］報(bào)道在匈牙利腦卒中人群中K等位基因具有保護(hù)作用，在小于50歲的卒中患者中K等位基因也明顯減少，R219K與腦梗死有關(guān)且獨(dú)立于HDL-C等血脂水平的改變。國(guó)內(nèi)研究也認(rèn)為［12］漢族腦梗死患者與健康對(duì)照組之間基因分布不同，漢族腦梗死患者中KK型更少，而RR型較多。KK型可能降低腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在男性、年齡大于65歲、高血壓的患者中，K等位基因可能是腦梗死的保護(hù)因素。有研究顯示［13］在688例健康人群中，R219K變異與血脂水平無關(guān)，但在無吸煙史的健康者中，K等位基因顯現(xiàn)出了降低頸動(dòng)脈中層內(nèi)膜厚度和減少斑塊進(jìn)展的能力，這可能是和K等位基因與減少腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)有一定的聯(lián)系。而Pasdar研究［14］表明在英國(guó)人群中R219K多態(tài)與缺血性卒中無明顯相關(guān)性，但KK基因型者LDL-C水平更高，TG水平更低。我們的既往研究中也表明漢族腦梗死患者與ABCA1 R219K不相關(guān)，但ABCA1基因的R219K多態(tài)RR型可能是男性患腦梗死的易感基因［15］。本研究結(jié)果表明R219K位點(diǎn)3種基因型在人群中分布不均衡，RK基因型最多見，RR、KK基因型較少見，等位基因頻率在各組間無明顯差別，而回族腦梗死患者KK基因型明顯較低，但分層分析后顯示只發(fā)生在回族男性和伴有高血壓的患者中。

腦梗死患者R219K多態(tài)與血脂的關(guān)系研究較少，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究表明［16］RR、RK和KK 3種基因型中，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平依次呈上升趨勢(shì)，ABCA1 R219K變異可影響血脂水平，攜帶者(RK+KK型)對(duì)血脂有益，以男性人群為主，這種作用在≤70歲人群尤其明顯。但我們的研究顯示R219多態(tài)RR型的TG水平較高，而HDL-C水平較低，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各基因型之間血脂水平無明顯差異，R219K對(duì)回、漢腦梗死患者的作用可能與血脂水平無關(guān)?？傊?，回、漢族腦梗死患者ABCA1基因的R219K多態(tài)性可能存在差異，回族腦梗死患者KK基因型較漢族低，但僅僅是發(fā)生回族男性和高血壓患者中，且其發(fā)生機(jī)制可能與血脂水平無關(guān)。

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