檢測(cè)豬戊型肝炎病毒的熒光定量PCR方法的建立

張亮權(quán)，歐陽(yáng)昀，劉志剛，曹宗喜，閆明菲，王文華，郭泗虎，張桂紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

戊型肝炎（hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的一種經(jīng)糞口途徑傳播的人獸共患病。從1955～1956年在印度新德里［1］第一次HE大暴發(fā)至今，HE已廣泛分布于亞洲、非洲及中美洲等發(fā)展中國(guó)家。新疆是我國(guó)HE的高發(fā)地區(qū)，曾在1986～1988年間暴發(fā)該病，是世界上一次大規(guī)模的流行，共計(jì)發(fā)病119280例，死亡707例［2］。

1997年Meng等［3］從豬體內(nèi)分離出1株野生型HEV，發(fā)現(xiàn)其與人類(lèi)的HEV有極高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，因此推測(cè)豬可能是HEV感染的一個(gè)動(dòng)物宿主。目前研究表明，HEV在豬群中普遍存在，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定是發(fā)展中國(guó)家的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，對(duì)豬源戊型肝炎（swHE）診斷方法的研究十分必要。而熒光定量PCR（Real-time PCR）具有快速、靈敏、特異等特點(diǎn)，適用于swHEV的檢測(cè)，本試驗(yàn)就建立了檢測(cè)豬群中HEV的熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與樣品來(lái)源 豬源戊型肝炎病毒（swHEV），豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬流感病毒（H1、H3亞型SIV）均由本研究室分離保存；16份膽汁樣品采集于廣東省某獸醫(yī)院。

1.2 主要試劑和儀器 AMV反轉(zhuǎn)錄酶，Ex Taq DNA聚合酶，pMDl8-T載體［寶生物工程（大連）有限公司］；SYBR qPCR MIX（TOYOBO公司）；熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7500型）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank中swHEV ORF2核苷酸序列的保守區(qū)域，應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)引物并由Invitrogen公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段為126bp。上游引物：5′-CAGAATTGATTTCGTCGG-3′；下游引物：5′-TAGCTATACCCTTGTCCTGCTG-3′。

1.4 樣品的處理 膽汁樣品用滅菌PBS配成10%的懸浮液，4℃～8000r／min離心10min，取上清，-40℃保存。

1.5 病毒RNA的提取與cDNA的合成 按Invitrogen公司TRIzol?Reagent RNA提取試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行總RNA的抽提，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-20℃保存。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備 以cDNA為模板，用上述的1對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將回收純化的PCR產(chǎn)物裝入pMD18-T載體，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD-swHEV。用分光光度計(jì)測(cè)量陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度，定量并稀釋至1.0×109拷貝／μL，-20℃保存。

1.7 熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng) 熒光定量PCR反應(yīng)總體積為20μL，其中SYBR qPCR MI×10μL，上、下游引物各0.8μL，模板1μL，滅菌去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min；95℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸35s并檢測(cè)熒光，40個(gè)循環(huán)。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及穩(wěn)定性分析 用滅菌去離子水將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋成1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝／μL，作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度作3次重復(fù)。

1.9 特異性試驗(yàn) 分別以swHEV、PRRSV、FMDV、CSFV、PCV2、H1和 H3亞型SIV的DNA或cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，并設(shè)立空白對(duì)照。

1.10 熒光定量PCR與逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR（RT-nPCR）的比較分析 分別用熒光定量PCR與RT-nPCR［4］檢測(cè)16份膽汁樣品進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r2）為0.998，以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）：y=-3.039x+37.983。

圖1 swHEV熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 穩(wěn)定性分析結(jié)果 用8個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，Ct值變異系數(shù)（CV）在0.17%～1.41%之間（表1），顯示出良好的重復(fù)性。

表1 熒光定量PCR的穩(wěn)定性分析

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 從圖2可知，對(duì)于swHEV出現(xiàn)了特異性的擴(kuò)增曲線，CT值為25.09。而對(duì)于PRRSV、FMDV、CSFV、PCV2、H1亞型SIV、H3亞型SIV以及陰性對(duì)照，均沒(méi)有產(chǎn)生熒光信號(hào)。

圖2 熒光定量PCR的特異性分析

2.4 熒光定量PCR與RT-nPCR的比較分析結(jié)果 分別用熒光定量PCR與RT-nPCR檢測(cè)16份膽汁樣品，結(jié)果顯示（表2），熒光定量PCR除了檢測(cè)出RT-nPCR檢出的7份陽(yáng)性外，還檢測(cè)出2份為陽(yáng)性，RT-nPCR的最低檢出濃度約為2.05×102拷貝／μL，而熒光定量PCR的最低檢測(cè)濃度約為1.52×101拷貝／μL，表明熒光定量PCR的檢測(cè)靈敏度比RT-nPCR約高10倍。

3 討論

HE是一種能引起人和多種動(dòng)物［3，5-6］感染的人獸共患病，人對(duì)HEV普遍易感，青壯年病死率可達(dá)1%～2%，孕婦病死率高達(dá)20%［7］。而豬感染HEV的現(xiàn)象普遍存在，因此，對(duì)swHEV診斷方法的研究具有重要的意義。

豬感染HEV后，很少有明顯的臨床癥狀［8］，這對(duì)swHEV的臨床診斷帶來(lái)很大的不便，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。RT-nPCR是檢測(cè)HEV核酸最常用的方法之一，然而swHEV病毒血癥持續(xù)時(shí)間和糞便的排毒時(shí)間都很短，而且載毒量低，使該檢測(cè)方法出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。與RT-nPCR相比，熒光定量PCR具有更高的特異性和靈敏度，可作為swHEV的有效檢測(cè)系統(tǒng)。

表2 熒光定量PCR與RT-nPCR的比較分析

本試驗(yàn)建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，并且具備良好的穩(wěn)定性，適用于swHEV的檢測(cè)，能為HEV的防治提供很好的技術(shù)支持。

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［4］劉志剛，曹宗喜，張得玉，等.廣東地區(qū)豬源戊型肝炎病毒的檢測(cè)和核苷酸序列分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，9：94-96.

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