53例北極狐皮膚癬病的病原菌分離鑒定

史振國，金藝鵬，孫艷爭，蔣 進，郭宇萌，林德貴

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193）

狐貍的皮膚癬病是影響狐貍養(yǎng)殖效益的一種重要疾病，主要表現(xiàn)為瘙癢、脫毛或者斷毛，患部出現(xiàn)大量皮屑，部分出現(xiàn)紅腫或者繼發(fā)感染，具有病程長、治愈難、易復(fù)發(fā)的特點，在皮毛動物的規(guī)?；B(yǎng)殖中，已經(jīng)漸漸引起人們的重視。狐貍的皮膚癬病在導(dǎo)致皮毛動物產(chǎn)品淘汰、降級的同時，還引起其他動物，包括人的皮膚病，對其病原菌進行實驗室分離、鑒定具有重要的公共衛(wèi)生意義。本試驗對山東養(yǎng)殖場53例患皮膚癬病的北極狐進行采樣，通過直接鏡檢、分離、培養(yǎng)、回歸易感動物、測序等，其中33例（陽性率為62.3%）須毛癬菌的培養(yǎng)為陽性，為北極狐皮膚癬病的主要致病性真菌。

1 病例選取與標(biāo)本收集

病例來自山東各養(yǎng)殖場中患皮膚癬病的北極狐，用消毒好的鑷子夾取患部及患部邊緣的毛發(fā)，置于無菌試管中。

2 病原的鑒定與觀察

2.1 直接鏡檢 將斷毛與皮屑置于載玻片上，滴入1滴10%KOH，置酒精燈上略微加熱，2～3min后置顯微鏡下觀察。

2.2 病原菌的培養(yǎng)、觀察與生化試驗 將斷毛和皮屑置于加有氯霉素和放線菌酮的沙氏培養(yǎng)基（SDA）中，26℃培養(yǎng)1周，觀察菌落特點；挑取培養(yǎng)好的菌落，用乳酸酚棉藍染色，鏡檢；并且制作小培養(yǎng)，觀察菌絲及孢子的生長規(guī)律；挑取原代菌落，置于尿素酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周，觀察顏色變化。

2.3 回歸易感動物 挑取原代菌落，用無菌生理鹽水稀釋，使?jié)舛葹?05CFU／mL，選用清潔級豚鼠10只，雌雄各半，剃掉背部兩側(cè)被毛，用砂紙摩擦豚鼠皮膚至即將出血，然后用無菌拭子，蘸取菌懸液，涂于背部兩側(cè)，每天觀察結(jié)果。

2.4 ITS區(qū)序列分析 按照文獻報道方法，常規(guī)提取菌株DNA，選用通用引物ITS1和ITS4，對ITS區(qū)序列進行擴增，PCR反應(yīng)體系為10倍緩沖液5 μL，dNTPs 4μL，Taq酶0.25μL，模板 DNA 0.3 μL，引物各1μL，ddH2O 38.4μL。循環(huán)條件：96℃預(yù)變性1min，95℃40s，52℃1min，72℃2min，擴增30個循環(huán)；最后1個循環(huán)后于72℃延伸7min。取5μL產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。將產(chǎn)物送北京華大基因測序，測序結(jié)果與GenBank上登錄的序列比對。

3 試驗結(jié)果

3.1 直接鏡檢顯示，北極狐被毛已經(jīng)被破壞，失去其完整結(jié)構(gòu)，毛體內(nèi)可見有毛內(nèi)小分生孢子。

3.2 培養(yǎng)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中生長迅速，呈白色、粉末狀菌落；菌落中心部有結(jié)節(jié)狀小隆起，有的有較粗大的放射狀溝紋，背面呈淡黃色。乳酸酚棉藍染色，可見大量的小分生孢子，并且可見到有螺旋樣菌絲，小培養(yǎng)可見小分生孢子呈簇狀生長，尿素酶試驗陽性。

3.3 動物試驗顯示，從接種之日算起，由第4天開始，豚鼠背部兩側(cè)皮損處邊緣被毛鏡檢陽性，一周之后，豚鼠背部兩側(cè)均出現(xiàn)大量皮屑，紅斑，皮膚增厚，10只豚鼠全部感染成功（成功率100%）。

3.4 ITS區(qū)序列與GenBank上公布的T.mentarophtes var.metarophytes rDNA序列ITS區(qū)序列同源性達99%，其中一例序列見下頁所示。

4 討論

根據(jù)臨床癥狀、直接鏡檢、實驗室培養(yǎng)、回歸易感動物、ITS區(qū)測序等結(jié)果顯示，山東地區(qū)引起北極狐皮膚癬病的主要致病菌是須毛癬菌。

須毛癬菌是一種重要的嗜角質(zhì)性真菌，通過分泌多種角蛋白酶來分解動物的被毛、皮膚和指甲等。體外試驗證明，須毛癬菌和犬小孢子菌等可以在不含有任何碳源和氮源，只含有動物被毛的培養(yǎng)基中生長良好［1］。

須毛癬菌是引起人的膿癬的主要致病性真菌，主要感染人的毛發(fā)、指甲和皮膚，表現(xiàn)為腫塊，膿皰和脫發(fā)［2］，少數(shù)情況下可以引起人的全身深部感染，表現(xiàn)為全身出現(xiàn)紅斑、丘疹、結(jié)節(jié)、小膿皰等癥狀［3］。而在寵物身上，須毛癬菌卻不是引起寵物皮膚癬病的主要致病性真菌，引起寵物皮膚癬病的主要致病性真菌是犬小孢子菌。據(jù)統(tǒng)計，大約45%的貓遭受過犬小孢子菌感染，被侵害的貓身上帶菌，成為傳染源，但其中90%的貓不表現(xiàn)臨床癥狀［4］。據(jù)吳金節(jié)等的報道，健康貓的被毛菌群中，其中犬小孢子菌的檢出率為14.29%，為主要的皮膚癬菌，而須毛癬菌的檢出率僅為5.14%［5］。據(jù)丁明星的報道，對11例發(fā)生皮膚癬病病貓的檢查發(fā)現(xiàn)，其中檢出犬小孢子菌4株，而須毛癬菌僅檢出1株［6］；而在本次試驗中，53例患皮膚癬病的北極狐，其中須毛癬菌的檢出陽性為33例，檢出率為62.3%，未檢出其他致病性皮膚癬菌，由此可見，引起北極狐皮膚癬病的致病性真菌和引起寵物皮膚癬病的致病性真菌的種類有顯著的差異。

［1］Wawrzkiewicz K，Zitikowska G，Wawrzkiewicz J.In vitro biodegradation of hair from different animal species by Microsporum canis［J］.International Biodeterioration ＆ Biodegradation，1997，39：15－25.

［2］劉艷，冉玉平.須毛癬菌所致膿癬病發(fā)的掃描和透射電鏡觀察及菌體外酶活性分析2例報告［J］.中國真菌學(xué)雜志，2009，4（3）：173－176.

［3］陳穎，劉茁.須毛癬菌引起全身多處皮膚深部感染1例報告［J］.中國皮膚病學(xué)雜志，2008，22（2）：108－109.

［4］高得儀.犬貓疾病學(xué).［M］.北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992：67－71.

［5］吳金節(jié)，劉亞.健康貓被毛真菌菌相［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，1999，19（3）：251－253.

［6］丁明星，林德貴.北京地區(qū)犬貓被毛真菌菌群的調(diào)查［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37（5）：504－509.