鉤藤總堿緩釋滴丸的制備、含量測定和釋放度考察Δ

劉 衛(wèi)，王 盟，楊雪萍，張 強，王中師，孫 昕（解放軍第88醫(yī)院藥劑科，泰安市 271000）

鉤藤總堿是茜草科植物鉤藤的主要成分，有明確的降低血壓的作用[1]，但在水中難溶，煮沸后不穩(wěn)定[2]，難以制成在水中完全分散的穩(wěn)定制劑。在考察鉤藤總堿性質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，它在1，2-丙二醇聚和聚乙二醇（PEG）中有很好的溶解性。因此，筆者制備了鉤藤總堿緩釋滴丸，以期改善鉤藤總堿的分散度和釋放度，達到抗高血壓藥所要求的持久平穩(wěn)降低血壓的目的。

1 儀器與試藥

滴丸制備裝置，參考文獻方法[3，4]，由我院自制；1200型高效液相色譜（HPLC）儀（美國安捷倫公司）；ZBS-8型智能溶出試驗儀（天津大學(xué)無線電廠）；UV-2401PC型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

鉤藤，購自廣西，經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系趙雪梅教授鑒定為真品，按先前報道的方法[5]提取得到鉤藤總堿；鉤藤堿、異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號分別為1266-070214、1385-090213，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，含量＞98%）；PEG6000（天津科密歐化工有限公司，批號：20070809001）；硬脂酸（常州佳業(yè)化工有限公司，批號：07111501）；1，2-丙二醇（天津博迪化工有限公司，批號：20070511）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鉤藤總堿緩釋滴丸處方和制備工藝的確定

按照滴丸劑的一般制法，取鉤藤總堿細(xì)粉與1，2-丙二醇混勻；將硬脂酸與PEG6000按比例混合后在水浴上加熱熔融，加入鉤藤總堿[5]混合物（總堿含量不低于90%），攪拌，溶解，保溫倒入滴丸裝置中，用規(guī)定的滴頭按規(guī)定的滴速滴入冰浴的液體石蠟冷凝劑中冷卻，固化成丸。

以鉤藤總堿與丙二醇混合后在處方中的含量（A）、硬脂酸與PEG6000比例（B）、滴制溫度（C）、滴速（D）為因素，每個因素選取3個水平，采用正交試驗法，以滴丸外觀質(zhì)量（硬度、圓整度、丸重差異）和藥物釋放度為指標(biāo)，外觀總體指標(biāo)和釋放度指標(biāo)權(quán)重各為0.5，對滴丸制備工藝進行優(yōu)選，確定最佳成型工藝。其中，滴丸硬度、圓整度和丸重差異[6]按照從好到差的順序人為分為5個等級，分別計1、2、3、4、5分；藥物釋放度參照2010年版《中國藥典》（二部）中緩釋、控釋和遲釋制劑指導(dǎo)原則的規(guī)定，用轉(zhuǎn)籃法[6]測定釋放度，考察以下3個時間點的累積釋放量作為評價指標(biāo)：1 h的累積釋放度（Q1），以30%為標(biāo)準(zhǔn)；4 h的累積釋放度（Q4），以60%為標(biāo)準(zhǔn)；10 h的累積釋放度（Q10），以80%為標(biāo)準(zhǔn)。各點的評分為：1 h的評分為|Q1－30|；4 h的評分為|Q6－60|；10 h的評分為|Q10－80|；綜合評分（K）＝|Q1－30|+|Q6－60|+|Q10－80|，K值越小，說明釋放度與所定的標(biāo)準(zhǔn)越接近，即處方越合理。因素水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

由表2、表3可知，影響滴丸成型工藝的因素依次為B＞A＞C＞D，其中B因素有顯著性意義。最佳組合為A1B2C2D2，并根據(jù)滴丸軟硬度調(diào)1，2-丙二醇的量，得到優(yōu)化的處方，即為鉤藤總堿細(xì)粉8.8 g，1，2-丙二醇3.6 g，PEG6000 14.1 g，硬脂酸3.5 g，制成1 000丸。制法為鉤藤總堿細(xì)粉（過100目）與1，2-丙二醇混勻；另取PEG6000、硬脂酸水浴熔融后，混勻，加入鉤藤總堿，攪拌，溶解，保溫70℃，用液體石蠟為冷凝液，滴距5 cm，滴速45 d·min-1，按每丸重30 mg制得滴丸。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.2 鉤藤總堿的含量測定方法

取本品6粒（相當(dāng)于鉤藤總堿約50 mg），精密稱定，研細(xì)，加氯仿使溶解，精確加入25 mL 0.01 mol·L-1硫酸標(biāo)準(zhǔn)液，在水浴上揮去氯仿，過濾，瓶中殘渣用適量蒸餾水洗滌2次，過濾，合并濾液和洗液，加入甲基紅-亞甲藍混合指示劑2滴，以0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液滴定，由櫻紅色至黃綠色為終點?？倝A量以鉤藤堿計，每1 mL 0.01 mol·L-1硫酸溶液相當(dāng)于7.68 mg鉤藤堿。

2.3 鉤藤堿、異鉤藤堿的含量測定方法

2.3.1 色譜條件色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：室溫；流動相：甲醇-水（60∶40）含10 mmol·L-1三乙胺，醋酸調(diào)pH值至7.5；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；測定波長：254 nm。在此色譜條件下，鉤藤堿的理論板數(shù)不低于1 500。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取鉤藤堿、異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.2、2.0、2.8、3.6、4.4 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下進樣20 μL，做HPLC分析。以進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為A鉤藤堿＝11.132x－1.232（r＝0.999 8）、A異鉤藤堿＝21.243x－2.081（r＝0.999 1）。結(jié)果表明，鉤藤堿和異鉤藤堿的進樣量分別在0.48～1.76 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 樣品含量測定 取鉤藤總堿20 mg，用甲醇溶解后濾過，25 mL容量瓶定容，按上述色譜條件進樣測定鉤藤總堿中鉤藤堿和異鉤藤堿的含量。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取鉤藤總堿適量，置水中制成混懸液，分別在60、90℃水浴中加熱60 min，放冷至室溫，用氯仿萃取，水浴蒸干，甲醇溶解，測定室溫及加熱狀態(tài)下鉤藤總堿、鉤藤堿和異鉤藤堿的含量。結(jié)果表明，鉤藤堿的穩(wěn)定性優(yōu)于異鉤藤堿，故選擇鉤藤堿為定量指標(biāo)。溫度對鉤藤總堿中各成分含量的影響見表4。

表4 溫度對鉤藤總堿中各成分含量的影響Tab 4 Effect of temperature on the content of components in rhomotoxine

2.3.5 鉤藤堿的加樣回收率試驗 精密稱定鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品約50 mg（A），與丙二醇混勻。將硬脂酸與PEG6000按處方比例混合，在水浴上加熱熔融，加入鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定（S1），攪拌混勻，保溫下倒入滴丸裝置中，按規(guī)定的方法制備滴丸100粒。取其中5丸，精密稱定（S2），計算其中鉤藤堿加入量（A×S2/S1），研細(xì)，用甲醇溶解，超聲處理40 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進樣，測定鉤藤堿含量，計算回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 5 Results of recovery tests

2.4 鉤藤總堿緩釋滴丸釋放度考察

2.4.1 對照樣品的制備 為觀察鉤藤總堿緩釋滴丸的緩釋效果，按照制備鉤藤總堿緩釋滴丸的方法制備鉤藤總堿普通滴丸作為對照，處方為鉤藤總堿細(xì)粉8.8 g，1，2-丙二醇3.6 g，PEG6000 17.6 g，制成1 000丸。

2.4.2 測定釋放度 藥物釋放度參照2010版《中國藥典》（二部）中緩釋、控釋和遲釋制劑指導(dǎo)原則的規(guī)定，用轉(zhuǎn)籃法[6]分別測定3批（批號：080623、080624、080625）鉤藤總堿普通滴丸的溶出度和鉤藤總堿緩釋滴丸的釋放度，以0.1 mol·L-1鹽酸作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，溫度為（37±0.5）℃，依法測定，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣5 mL，同時補充同體積同溫度的溶出介質(zhì)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，測定鉤藤堿濃度，計算累積釋放度，繪制體外時間-濃度曲線。結(jié)果，鉤藤總堿緩釋滴丸釋放緩慢且釋放完全。鉤藤總堿緩釋滴丸體外時間-濃度曲線見圖2。

2.4.3 重復(fù)性試驗 制備鉤藤總堿緩釋滴丸3批（批號：080623、080624、080625），按上述方法測定釋放度。結(jié)果，鉤藤總堿緩釋滴丸3批每個時間點累積釋放百分率RSD＜5%，表明該產(chǎn)品累積釋放度重復(fù)性好。鉤藤總堿緩釋滴丸的釋放度重復(fù)性測定結(jié)果見表6。

表6 鉤藤總堿緩釋滴丸的釋放度重復(fù)性測定結(jié)果Tab 6 Reproducibility experiment of release rate of Rhomotoxine sustained-release dropping pills

2.4.4 釋藥模型擬合 將批號分別為080623、080624、080625的緩釋滴丸的釋放度結(jié)果用零級模型、一級模型和Higuchi模型進行擬合。結(jié)果，Higuchi模型擬合的r＝0.992 3，為最大，表明本制劑釋藥過程符合Higuchi方程。鉤藤總堿緩釋滴丸的釋藥模型擬合見表7。

表7 鉤藤總堿緩釋滴丸的釋藥模型擬合Tab 7 Fitted drug release model of Rhomotoxine sustained-release dropping pills

3 討論

滴丸劑是一固體分散制劑，通常以水溶性載體為基質(zhì)制成滴丸，有提高藥物分散度、加快藥物溶出速率的作用，加入水不溶性基質(zhì)可使普通滴丸具有緩釋特性，這樣既可以增加藥物的分散度，又能達到緩慢、平穩(wěn)釋藥的目的。本試驗采用了水溶性載體PEG6000和水不溶性載體硬脂酸聯(lián)合使用，制成了鉤藤總堿緩釋滴丸。滴丸成型工藝研究一般以圓整度、色澤、硬度等作為評價指標(biāo)，但它們是一種非量化的主觀判斷，難以全面客觀地反映滴丸的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗以滴丸的外觀質(zhì)量加丸重差異和累積釋放度等為綜合指標(biāo)，通過正交試驗對滴丸的成型工藝進行優(yōu)化篩選，同時考慮了制劑的外觀和緩釋特性。

鉤藤總堿是鉤藤的主要有效成分，而異鉤藤堿和鉤藤堿是鉤藤總堿的主要組成成分，具有降低血壓的作用，作用強度順序是異鉤藤堿＞鉤藤堿＞鉤藤總堿[7]?？梢?，異鉤藤堿和鉤藤堿有條件作為滴丸的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。由于異鉤藤堿不穩(wěn)定，加熱條件下短時間內(nèi)即發(fā)生分解，所建方法的不穩(wěn)定，所以采用鉤藤堿一種成分來進行滴丸的質(zhì)量控制。試驗證明，該方法穩(wěn)定可靠，且操作簡單，條件易控制。

釋放度是評價緩釋制劑的重要指標(biāo)，其試驗方法應(yīng)盡量模擬藥物在體內(nèi)釋放和吸收過程，本試驗以0.1 mol·L-1鹽酸為釋放介質(zhì)，模擬體內(nèi)環(huán)境。結(jié)果表明，鉤藤總堿緩釋滴丸在0.1 mol·L-1鹽酸中的釋放時間超過2 h，藥物在體內(nèi)此時應(yīng)已進入小腸堿性環(huán)境中，所以該制劑在堿性環(huán)境中的釋藥特性有待進一步確定。

[1] 何 昱，洪筱坤，王智華.鉤藤及其有效成分的藥理研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2003，37（11）：57.

[2] 黃卓謙，劉建利，王玉英，等.鉤藤煎煮過程中化學(xué)成分變化的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報，2008，38（10）：787.

[3] 俞慧琴，潘榮富.介紹一種滴丸制備裝置[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1986，6（9）：37.

[4] 孫 昕，魏 強，呂泰省，等.復(fù)方麝香草腦滴丸研制[J].中國藥房，1997，8（6）：262.

[5] 王 盟，劉 衛(wèi)，邱慶浩，等.正交試驗法優(yōu)選鉤藤總堿提取工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28（9）：1 200.

[6] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄11.

[7] 王 盟，劉 衛(wèi).鉤藤總生物堿的研究進展[J].實用醫(yī)藥雜志，2008，25（3）：361.