HPLC 法測定蝙蝠葛堿與大鼠和人血漿蛋白的結(jié)合率

高秀蓉，蔣學(xué)華，王婷（.四川大學(xué)華西藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥事管理學(xué)系，成都市6004；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑教研室，成都市 60083）

北豆根為防己科蝙蝠葛屬多年生藤本植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC的干燥根莖，1977年版《中國藥典》始見北豆根，具有抗炎、抗菌、抗癌、清熱解毒、消腫利咽和止痛的功效，以及心血管系統(tǒng)作用，目前臨床用于治療扁桃體炎、咽喉腫痛、牙齦腫痛等[1]。北豆根主要成分為生物堿，現(xiàn)已知北豆根中含有近20種生物堿，總堿含量為1%以上，其中含量最高的為蝙蝠葛堿（Dauricine）[2，3]。蝙蝠葛堿是一種廣譜的抗心律失常藥，適用于快速型心律失常，尤其對房性、交界性和室性早搏效果較佳；對預(yù)激綜合征伴室性心動過速效果也好[4，5]。

血漿蛋白結(jié)合率是藥物重要的藥動學(xué)參數(shù)，藥物與血漿蛋白結(jié)合后將不能被機體處置（如分布、代謝和排泄），僅游離藥物能發(fā)生這些藥動學(xué)過程和發(fā)揮藥理作用，所以血漿蛋白結(jié)合率的高低將直接影響藥物在血中游離藥物的濃度，從而影響藥物藥理作用的發(fā)揮和毒性作用[6]。蝙蝠葛堿屬于雙芐基異喹啉類生物堿，屬于毒性藥物，治療窗較窄，本課題組對蝙蝠葛堿在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程進行了研究，發(fā)現(xiàn)其口服生物利用度低（約15%），生物半衰期較長（大鼠血漿中約5～7 h），對其血漿蛋白結(jié)合率進行測定將有助于解釋這些體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)和體內(nèi)過程。而目前尚未見文獻(xiàn)對蝙蝠葛堿血漿蛋白結(jié)合率進行測定，故筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對蝙蝠葛堿的人和大鼠血漿蛋白結(jié)合率進行了測定，以期為臨床合理設(shè)計蝙蝠葛堿給藥方案提供依據(jù)，也為蝙蝠葛堿制劑的研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2010C HT型高效液相色譜儀（日本Shimdazu公司）；BP210S型、CP235D型電子天平（德國Sartorius公司）；Votex Genius 3型旋渦混合儀（德國IKA公司）；HGC-36AC型氮吹儀（上海泉島科貿(mào)有限公司）；CQ-205型超聲清洗儀（上海超聲波儀器廠）；TDL-5型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；超純水機（成都品成科技有限公司）；透析袋（上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司，截留分子量8 000～15 000 Da）。

1.2 試藥

蝙蝠葛堿原料藥（純度：＞98.0%）、蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度：＞99.0%）均由深圳市維琪生物科技有限公司提供；粉防己堿（內(nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定所，純度：＞99.5%）；HPLC所用試劑為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SD大鼠10只，♂，體重220～250 g，由四川大學(xué)實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2005-02）；大鼠腹主動脈取血，肝素抗凝，離心，分離血漿，－20℃貯藏，備用。人血漿由成都市血液中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 空白透析液的制備 稱取磷酸二氫鈉1.563 g，氯化鈉4.437 g，加超純水溶解，用1 mol·L-1的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.4，定溶至500 mL，0.45 μm的微孔濾膜過濾后，即得0.02 mol·L-1、pH7.4的磷酸二氫鈉緩沖液（含0.15 mol·L-1氯化鈉）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的制備 稱取干燥至恒重的蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解制備成濃度為302.00μg·mL-1的蝙蝠葛堿貯備液，吸取該貯備液2 mL，甲醇定容于10 mL容量瓶中，得濃度為60.40μg·mL-1的工作溶液①，精密吸取工作溶液①5 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇定容，得濃度為30.20μg·mL-1的工作液②；依次往下稀釋，分別得濃度為15.10、7.55、3.78、1.89和0.94 μg·mL-1的系列工作液，4 ℃貯藏，備用。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)液的制備 稱取粉防己堿1.44 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，得28.8 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Sepax C18（250 mm×5.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（78∶22，含1%三乙胺和0.21%磷酸）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：284 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.3 樣品處理

2.3.1 透析內(nèi)液樣品的處理 精密吸取透析袋內(nèi)液100 μL，加入25 μL內(nèi)標(biāo)液，渦旋混勻后加入500 μL乙酸乙酯、100 μL 2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液堿化，強力混旋5 min，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液用N2吹干，用100 μL流動相復(fù)溶，混旋，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液于“2.2”項下色譜條件測定。

2.3.2 透析外液樣品的處理 取透析袋外液100 μL，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液于“2.2”項下色譜條件測定。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法專屬性考察 分別取空白血漿、空白透析液及含蝙蝠葛堿的血漿樣品或透析液樣品，按照“2.3”項下方法處理樣品，在“2.2”項下色譜條件測定，可見空白血漿、空白透析液在此條件下對蝙蝠葛堿的測定無干擾。蝙蝠葛堿HPLC見圖1。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 （1）透析外液：取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液各25μL，加入75μL空白透析液，渦旋混勻，得蝙蝠葛堿溶液濃度分別為15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 μg·mL-1的透析外液標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.3”項下方法進行樣品處理和“2.2”項下色譜條件測定。以蝙蝠葛堿的峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，蝙蝠葛堿濃度（X）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得蝙蝠葛堿回歸方程為Y＝34 026.70X+2 801.21（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，透析外液中的蝙蝠葛堿檢測濃度在0.24～15.10 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值線性關(guān)系良好。（2）透析內(nèi)液（大鼠血漿）：取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液各25μL，分別加入75μL空白大鼠血漿，渦旋混勻，得蝙蝠葛堿溶液濃度分別為15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 μg·mL-1的含藥血漿，然后分別加入25 μL內(nèi)標(biāo)液。按“2.3”項下方法處理樣品和“2.2”項下色譜條件進行測定。以蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品和粉防己堿內(nèi)標(biāo)液的峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，血漿中的蝙蝠葛堿濃度（X）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.155 8X+0.005 7（r＝0.998 8）。結(jié)果表明，大鼠血漿中蝙蝠葛堿檢測濃度在0.24～15.10 μg·mL-1范圍內(nèi)與蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品和粉防己堿內(nèi)標(biāo)液的峰面積之比線性關(guān)系良好。（3）透析內(nèi)液（人血漿）：取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液各25μL，加入75μL空白人血漿，渦旋混勻，得蝙蝠葛堿濃度分別為15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 μg·mL-1的含藥血漿，然后分別加入25μL內(nèi)標(biāo)液。按“2.3”項下方法處理樣品和“2.2”項下色譜條件測定。以蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品和粉防己堿內(nèi)標(biāo)液的峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，血漿中的蝙蝠葛堿濃度（X）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.172 3X+0.004 0（r＝0.998 9）。結(jié)果表明，人血漿中蝙蝠葛堿檢測濃度在0.24～15.1 μg·mL-1范圍內(nèi)與蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品和粉防己堿內(nèi)標(biāo)液的峰面積之比線性關(guān)系良好。

圖1 蝙蝠葛堿的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of dauricine

2.4.3 血漿樣品提取回收率考察 精密吸取大鼠血漿（或人血漿）75 μL，加入25 μL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，配制蝙蝠葛堿高、中、低濃度（7.55、1.89、0.47 μg·mL-1）樣品，以提取后的蝙蝠葛堿峰面積與未經(jīng)提取直接進樣所獲得色譜峰面積之比，考察樣品的絕對提取回收率，每個濃度平行測定5份。結(jié)果表明，蝙蝠葛堿在大鼠和人血漿中提取回收率較高，基本達(dá)到80%以上。蝙蝠葛堿和內(nèi)標(biāo)在大鼠和人血漿中的萃取回收率見表1（表中IS為內(nèi)標(biāo)）。

2.4.4 精密度和方法回收率考察 （1）透析外液精密度考察：按“2.4.2”項下方法操作，測定蝙蝠葛堿高、中、低（7.55、1.89、0.47μg·mL-1）濃度樣品，測定日內(nèi)精密度和一周內(nèi)3 d的日間精密度，每個濃度平行5份，結(jié)果見表2。（2）大鼠血漿精密度考察：按“2.4.2”項下方法測定蝙蝠葛堿高、中、低（7.55、1.89、0.47μg·mL-1）濃度樣品，測定日內(nèi)精密度和一周內(nèi)3 d的日間精密度，每個濃度平行5份，結(jié)果見表2。（3）人血漿精密度考察：按“2.4.2”項下方法測定蝙蝠葛堿高、中、低濃度（7.55、1.89、0.47 μg·mL-1）樣品，測定日內(nèi)精密度和一周內(nèi)3 d的日間精密度，每個濃度平行5份，結(jié)果見表2。

表1 蝙蝠葛堿和內(nèi)標(biāo)在大鼠和人血漿中的萃取回收率（%，n＝4）Tab 1 Extraction recovery rates of dauricine and IS in rat and human plasma（%，n＝4）

表2 精密度試驗結(jié)果Tab 2 Results of precision tests

2.4.5 蝙蝠葛堿穩(wěn)定性考察 （1）蝙蝠葛堿在透析外液和透析內(nèi)液中穩(wěn)定性考察：按“2.4.2”項下方法配制蝙蝠葛堿高、低（7.55、0.47 μg·mL-1）濃度樣品，于4 ℃放置，分別于0、12、24、36 h取樣進行測定。結(jié)果，RSD＝2.63%，表明4℃條件下蝙蝠葛堿在透析外液中放置36 h穩(wěn)定。（2）蝙蝠葛堿在大鼠血漿中的穩(wěn)定性考察：按“2.4.2”項下方法，配制蝙蝠葛堿高、低（7.55、0.47 μg·mL-1）濃度樣品，于4℃放置，分別于0、12、24、36 h取樣進行測定。結(jié)果，RSD＝3.13%，表明4℃條件下蝙蝠葛堿在大鼠血漿中放置36 h穩(wěn)定。（3）蝙蝠葛堿在人血漿中的穩(wěn)定性考察：按“2.4.2”項下方法，配制蝙蝠葛堿高、低（7.55、0.47μg·mL-1）濃度樣品，于4 ℃放置，分別于0、12、24、36 h取樣進行測定。結(jié)果，RSD＝4.25%，表明4℃條件下蝙蝠葛堿在人血漿中放置36 h穩(wěn)定。

2.5 透析膜物理吸附的考察

2.5.1 蝙蝠葛堿供試液的制備 稱取蝙蝠葛堿2.59 mg，用稀鹽酸溶解后用1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6～7，用PBS定容至250 mL，得10.36 μg·mL-1高濃度供試液；取高濃度供試液50 mL，用PBS定容至100 mL，得5.18 μg·mL-1的中濃度供試液；取高濃度供試液10 mL，用PBS定容至100 mL，得1.04 μg·mL-1低濃度供試液。

2.5.2 考察透析膜對藥物的物理吸附作用 先將透析袋預(yù)處理后在空白透析液中室溫浸泡24 h。取一端扎緊的透析袋，除去袋內(nèi)外水分，透析袋內(nèi)加入2 mL（V1）空白透析液，將其放人盛有20 mL（V2）含藥（藥物濃度為c1）透析液的廣口瓶中，4℃中放置36 h至其平衡，然后測定透析袋外的藥物濃度（c外）（n＝3）。透析膜對藥物的吸附率用下式計算：

結(jié)果，蝙蝠葛堿在高、中、低（10.36、5.18、1.04 μg·mL-1）濃度下的吸附率分別為4.1%，3.3%，1.61%，表明透析袋對蝙蝠葛堿幾無吸附作用。

2.6 大鼠血漿中平衡時間的考察及血漿蛋白結(jié)合率的測定[7]

試驗前先將透析袋預(yù)處理后在空白透析液中室溫浸泡24 h。取一端扎緊的透析袋，除去袋內(nèi)外水分，精密吸取2 mL空白大鼠或人血漿加至透析袋中，扎緊袋口，懸浮于盛有20 mL含藥透析液的廣口棕色瓶中，調(diào)整透析袋位置使袋內(nèi)外液面保持同一水平，并避免貼瓶壁，密封瓶口，置于4℃中放置，分別于6、12 h取透析袋內(nèi)外樣品100μL，待測。待24 h透析結(jié)束時，吸取透析外液，加入三氯醋酸溶液，若有白色絮狀物出現(xiàn)，則證明有血漿蛋白漏出，該樣品作廢；無血漿蛋白漏出者，分別取透析袋內(nèi)外樣品并測定藥物濃度，計算血漿蛋白結(jié)合率。血漿蛋白結(jié)合率的計算公式如下：

結(jié)果表明，蝙蝠葛堿在24 h時在大鼠或人血漿中透析已達(dá)到平衡；在高、中、低（10.36、5.18、1.04 μg·mL-1）濃度下，蝙蝠葛堿大鼠血漿蛋白結(jié)合率分別為（69.63±1.3）%、（68.64±1.10）%、（72.54±0.50）%，人血漿蛋白結(jié)合率分別為（82.10±1.00）%、（84.96±0.70）%、（78.79±0.6）%，經(jīng)過t檢驗分析，同種屬內(nèi)高、中、低濃度下無顯著性差異（P＞0.05）。表明在1.04～10.36 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，蝙蝠葛堿的大鼠或人血漿蛋白結(jié)合率無濃度依賴性，蝙蝠葛堿具有中等偏強的血漿蛋白結(jié)合率。蝙蝠葛堿的大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率測定結(jié)果見表3。

表3 蝙蝠葛堿的大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of binding rate of dauricine to rat and human plasma protein（n＝3）

經(jīng)過t檢驗分析，比較蝙蝠葛堿在大鼠和人血漿中蛋白結(jié)合率，蝙蝠葛堿血漿蛋白結(jié)合率具有種屬差異性（P＜0.05），且人血漿蛋白結(jié)合率較大鼠血漿蛋白結(jié)合率高。

3 討論

目前，血漿蛋白結(jié)合率最常用的方法為平衡透析法，與其他方法比較，該方法具有簡單、快速和成本較低的特點，但同時也存在一些缺點，如通常平衡時間較長、血漿和藥物在37℃下長時間放置易不穩(wěn)定或變質(zhì)、透析膜可能對藥物存在吸附等問題。為克服血漿變質(zhì)的問題，有許多選擇在低溫條件下（如4℃）進行試驗，本試驗在預(yù)試驗時發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛堿在37℃條件下長時間放置（放置12 h）不穩(wěn)定，血漿蛋白也易變質(zhì)，故選擇在4℃條件下進行試驗。

本研究結(jié)果表明，蝙蝠葛堿在1.04～10.36 μg·mL-1范圍內(nèi)，蝙蝠葛堿的大鼠或人血漿蛋白結(jié)合率無濃度依賴性，說明蝙蝠葛堿在該濃度下與血漿蛋白的結(jié)合未達(dá)到飽和。本課題組在前期的對蝙蝠葛堿在體實驗中研究發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛堿大鼠iv后半衰期期較長（約5～7 h），推測與其較高強度的血漿蛋白結(jié)合率有直接關(guān)系。

由于體外試驗條件（透析溫度、藥物濃度和緩沖液pH值等）均不能完全模擬藥物在體內(nèi)的環(huán)境，故體外試驗結(jié)果不能完全代表藥物的體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率，該結(jié)果可作為體內(nèi)真實血漿蛋白結(jié)合率的參考?？蛇M一步進行體內(nèi)實驗，研究蝙蝠葛堿在組織中（如血漿、心、肝、脾、肺、腎、腦等）的分布，比較藥物在血漿和組織中濃度差異，從而判斷其與血漿蛋白結(jié)合的程度，體內(nèi)、外研究結(jié)果結(jié)合起來，結(jié)果將更為可靠。

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