黃芩苷、黃芩苷磷脂復合物與黃芩苷磷脂復合物鼻用溫敏型原位凝膠的鼻黏膜滲透性研究Δ

葉英杰，李楠，陳祝君，向小飛，黃亮，鄒文銓，楊明，3(.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都市637；2.四川大學華西藥學院，成都市6004；3.江西中醫(yī)學院中藥現(xiàn)代制劑教育部重點實驗室，南昌市330004)

黃芩苷屬黃酮類化合物，具有多項藥理作用，臨床應用廣泛。由于其具有清除自由基、抗氧化、抗炎、對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、保護內(nèi)皮細胞、抗各種腦水腫及抗缺血再灌注損傷等作用，用于治療缺血性腦血管疾病已成為臨床研究的熱點[1]。但因其脂溶性、水溶性差等原因造成體內(nèi)吸收差、生物利用度低、藥效不穩(wěn)定，從而限制了藥效的充分發(fā)揮[2]。為了改善這一情況，提高黃芩苷的生物利用度，前人研制了黃芩苷磷脂復合物以改善其理化性質(zhì)，從而改善體內(nèi)吸收情況[3]。

鼻腔給藥系統(tǒng)是一種新型的給藥系統(tǒng)，通過鼻腔給藥，藥物可繞過血腦屏障而入腦，有望成為靜脈注射的替代給藥途徑。鼻用溫敏型原位凝膠(Nasal in-situ gel)能霧化使以溶液狀態(tài)給藥，易于到達鼻黏膜，利用鼻腔特殊的環(huán)境溫度(32～34℃)，使得在鼻腔中及時發(fā)生相轉(zhuǎn)變而形成凝膠，黏附于黏膜表面，延長在鼻腔的保留時間，達到緩釋長效的目的，且能減少藥物流失，增加藥物吸收，有利于藥物經(jīng)鼻向腦轉(zhuǎn)運[4～7]。因此，在黃芩苷磷脂復合物的基礎(chǔ)上研制了黃芩苷磷脂復合物鼻用溫敏型原位凝膠，以擴大臨床應用。

Franz擴散池主要應用于體外藥物滲透性試驗，模擬體內(nèi)生理情況對藥物的膜滲透性進行評價[7]。本文通過體外鼻黏膜滲透性試驗比較了黃芩苷磷脂復合物溶液、黃芩苷溶液和3種不同處方的黃芩苷磷脂復合物的鼻用溫敏型原位凝膠的鼻黏膜滲透性，確定了黃芩苷磷脂復合物、黃芩苷溶液和黃芩苷磷脂復合物鼻用溫敏型凝膠的體外釋藥曲線，并對黃芩苷磷脂復合物鼻用溫敏型凝膠的處方進行了篩選。

1 儀器與材料

1.1 儀器

85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(上海金鵬分析儀器有限公司)；FA1104型電子天平(上海精科儀器廠)；BP211D型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；TGL-16G型高速離心機(上海安亭科學儀器有限公司)；戴安高效液相色譜(HPLC)儀，包括P680四元泵、TCC-100型柱溫箱、ASI-100型自動進樣器、UVD170U型紫外檢測器(戴安中國有限公司)；Franz擴散池(筆者自制)。

1.2 試藥

黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-200514)；黃芩苷提取物(筆者自制，含量:85%)；大豆卵磷脂(成都科龍化工試劑廠，批號:S20020037，含氮量:＞99.8%)；甘露醇(成都科龍化工試劑廠，批號:000308)；PEG6000(廣州市化學試劑玻璃儀器批發(fā)部，批號:911128)；三乙醇胺(成都科龍化工試劑廠，批號:000258)；生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號:060221502)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

豬，♀♂兼用，體重(70±5)kg，由四川省成都市溫江區(qū)天府鎮(zhèn)屠宰場提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷分析方法的建立[8]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)；流速:1.0 mL·min-1；檢測波長:280 nm；柱溫:40℃；進樣量:40 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應不低于2000。

2.1.2 檢測波長的確定取黃芩苷對照品溶液及供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，在檢測器上進行紫外掃描(200～350 nm)。結(jié)果表明，黃芩苷對照品溶液及供試品溶液在280 nm波長處有最大吸收，故選擇280 nm作為檢測波長。

2.1.3 標準曲線的制備精密稱取黃芩苷對照品適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得310 μg·mL-1的對照品貯備液。取1 mL置于10 mL量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，配制成31 μg·mL-1的對照品溶液，分別進樣1、2、4、8、16、32 μL，記錄色譜圖。以黃芩苷進樣量(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝45.405X+0.0513(r＝0.9999)。結(jié)果表明，黃芩苷進樣量在0.031～0.992 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.1.4 回收率試驗按“2.1.3”項下方法操作，制備高、中、低濃度的黃芩苷樣品溶液，測定其峰面積，依據(jù)外標法計算濃度，測得平均回收率為(100.07±2.6)%，其RSD＜2%。

2.1.5 精密度試驗按“2.1.3”項下方法操作，選擇高、低濃度的黃芩苷溶液，分別于1 d內(nèi)重復測定5次，得日內(nèi)RSD均＜2%；連續(xù)5 d測定，得日間RSD均＜2%。

2.2 黃芩苷磷脂復合物的制備

黃芩苷和大豆卵磷脂的投物料比為1∶2(W/W)，加入一定體積的四氫呋喃為溶劑，使黃芩苷藥物濃度為2.5 mg·mL-1，在55～60℃恒溫水浴中以120 r·min-1磁力攪拌1 h，減壓回收溶劑，真空干燥，即得黃芩苷磷脂復合物。將制備好的黃芩苷磷脂復合物加入適量的氯仿，充分溶解其中的磷脂及復合物，收集沉淀，干燥，即得黃芩苷磷脂復合物粉末。HPLC法測得復合物中黃芩苷的含量為30%。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 黃芩苷溶液精密稱取黃芩苷0.033 g，于pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液中研磨溶解，定容至10 mL，即得。

2.3.2 黃芩苷凝脂復合物溶液精密稱取黃芩苷凝脂復合物0.1 g，于pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液中研磨溶解，置于10 mL容量瓶中，以pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液定容至10 mL，3000 r·min-1離心10 min后取上清液，即得。

2.3.3 黃芩苷磷脂復合物鼻用溫敏型原位凝膠根據(jù)各處方精密稱取藥物，先將黃芩苷置研缽中，加入適量的三乙醇胺溶液(0.1%)研磨溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至西林瓶中，分次用三乙醇胺溶液洗滌，將洗滌液合并至西林瓶中后加入其他輔料。將西林瓶置冰浴4℃磁力攪拌下使其分散均勻，置4℃冰箱中保存24 h，直至聚合物完全溶解得到澄明溶液。

黃芩苷凝膠膠凝溫度的測定:將溫度計插入裝有黃芩苷凝膠的西林瓶中，同時加入攪拌石，開啟數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，緩慢升溫，直到攪拌石不再轉(zhuǎn)動，立即停止，讀出溫度計上的數(shù)字，即為黃芩苷凝膠膠凝溫度。選擇膠凝溫度為30～35℃之間的凝膠進行黏膜滲透試驗。黃芩苷凝膠各處方藥物含量見表1(加三乙醇胺水溶液至10 g)。

表1 黃芩苷凝膠各處方藥物含量Tab 1The drug content of each prescription of baicalin gel

2.4 試驗操作與裝置[9]

將死亡2 h內(nèi)的豬鼻部取下，切開鼻腔，暴露出鼻中隔及兩側(cè)鼻甲骨，用一個圓頭的細玻璃棒及鑷子將覆蓋在其上的鼻腔薄膜小心剝離，用生理鹽水洗凈薄膜上殘留的血跡，再將薄膜放在一片鋁箔上，鋪開，立即使用。

本試驗采用Franz擴散池法，裝置分為兩部分，即供給室與接受室，有效擴散面積為3.14 cm2，接受池容積為14 mL。在Franz擴散池接受室內(nèi)加入電磁攪拌子(長為0.9 cm，寬為0.4 cm)和氯化鈉溶液14 mL，并及時排出氣泡。將豬鼻黏膜層固定在接受室和供給室之間，置于水浴溫度35～37℃、3000 r·min-1的恒溫磁力攪拌器上，平衡20 min。用1 mL移液管加入1 mL藥液均勻覆蓋供給室豬鼻黏膜上，分別于15、30、45、60、90、120、150、180、240、300 min各取樣1 mL，每次取樣后補足氯化鈉溶液1 mL。10000 r·min-1離心5 min后取上清液，作為樣品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件操作，進樣量為40μL。HPLC法測定樣品中黃芩苷的濃度，計算單位面積累積滲透量()和穩(wěn)態(tài)透膜速率(Js)。

2.5 統(tǒng)計學方法

根據(jù)下列公式計算各個時間點黃芩苷磷脂復合物的μg·cm-2):

式中，V為Franz擴散池接收室的體積(14 mL)；A為Franz擴散池有效擴散面積(3.14 cm2)；Cn為第n次取樣時接受液的濃度；Ci為第i次取樣時接受液的濃度；ΣCiVi為取樣所損失藥量的累積和。

將以上各樣品的對滲透時間t進行回歸處理，直線斜率即為J(sμg·cm-2·h-1):

2.6 體外滲透率試驗結(jié)果

不同時間段的見表2；不同時間段單位面積釋藥曲線見圖1；每種樣品Js值(μg·cm-2·h-1)柱形比較見圖2。

表2 不同時間段的QTab 2Accumulated release amount per unit area in different time

圖1 不同時間段單位面積釋藥曲線Fig 1drug release curves per unit area in different time

圖2 每種樣品Js值(μg·cm-2·h-1)柱形比較圖Fig 2Column comparison chart of Jsvalue of each sample(μg·cm-2·h-1)

由表2、圖1可知，5種被測樣品均能透過豬鼻黏膜，且黃芩苷磷脂復合物溶液在每個時間點透過的濃度最高。前15 min每個樣品的接受池中均檢測不到黃芩苷，證明每個樣品在滲透時均有一定的滯留時間。藥物的對時間呈良好的線性關(guān)系，符合一級動力學方程。最后300 min的為黃芩苷磷脂復合物＞處方二＞處方一＞處方三＞黃芩苷溶液。黃芩苷凝膠3個不同的處方在15～90 min時滲透量差異不大，但在90 min后處方二的優(yōu)勢較為明顯。由圖2可看出，各個樣品的Js值大小仍為黃芩苷磷脂復合物＞處方二＞處方三＞處方一＞黃芩苷溶液。

3 討論

在體外透膜或透皮試驗過程中，接受液的選擇十分重要。為了更確切地描述體內(nèi)過程，接受液應具有接受透膜或透皮藥物的能力，并盡可能地符合類似體內(nèi)的漏槽條件。常用的接受液有生理鹽水、林格氏液和等滲的磷酸鹽緩沖液等[10]。本研究前期試驗中以主藥溶解性能為依據(jù)，對生理鹽水與pH 5.8、pH 6.5的磷脂緩沖液及加入促滲透劑乙醇、PEG400進行溶解性測定，直接測定黃芩苷在不同接受液中的飽和濃度，最后選擇生理鹽水為接受液。

有研究發(fā)現(xiàn)在采用體外豬鼻黏膜的滲透池擴散試驗時，離體的豬鼻黏膜在8 h內(nèi)可保持生理活性[11，12]。因此，在整個試驗過程中可保證所有離體鼻黏膜組織和生理上的完整性避免誤差。試驗設(shè)計各個樣品中所含黃芩苷濃度一致，從而可避免藥物濃度的差異對滲透過程的干擾。試驗中選擇嗅區(qū)鼻黏膜以盡量模擬體內(nèi)鼻腔給藥形式，因為“鼻-腦”通路主要是通過嗅區(qū)黏膜的吸收而直接入腦。

黃芩苷磷脂復合物溶液的和Js都遠遠高于黃芩苷溶液。黃芩苷制成磷脂復合物后其水溶性和脂溶性都得到極大的改善是造成這一現(xiàn)象的主要原因。因為黃芩苷磷脂復合物在水中溶解量是黃芩苷的4.56倍；在正辛醇中，其溶解量約是黃芩苷的70.17倍。復合物溶液同凝膠劑的比較中，由于凝膠基質(zhì)會影響藥物的釋放導致凝膠劑的和Js都低于黃芩苷磷脂復合物溶液。但是，由于溶液劑給藥后，患者的吞咽過程會造成藥物流失過多且患者順應性較差；而溫敏型凝膠由于鼻腔的溫度而發(fā)生膠凝形成凝膠黏附于鼻黏膜上，大大減少了藥物的損失，同時患者也容易接受，更加適用于鼻腔給藥。由黃芩苷凝膠3種處方的試驗結(jié)果比較可見，處方二的和Js都最高，所以選擇處方二為最佳處方。

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