采用UPLC-ESI-MS快速測定博落回各器官中主要生物堿的含量

鐘明 ，黃可龍，曾建國，黎霜，佘金明，張麗

(1. 中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙，410083；2. 湖南省中藥提取工程研究中心，湖南 瀏陽，410301；3. 湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 岳陽，414006)

博落回(Macleagua cordata(Willd)R.Br.)系罌粟科博落回屬植物，俗稱號筒桿、落回等，在我國的大部分省、自治區(qū)以及日本等都有分布。博落回在我國的藥用歷史有1 000多年，《本草綱目》《本草拾遺》及《中藥志》等均有記載。博落回常以干燥的全草入藥，具有驅(qū)蟲、抗菌、消腫、平喘、鎮(zhèn)痛等功效[1-3]，臨床上已用于痔瘡、膿性指頭炎、滴蟲性陰道炎、宮頸糜爛等治療[4]。研究表明：博落回全草中含有多種生物堿，包括原阿片堿(PRO)、別隱品堿(ALL)、血根堿(SA)、小檗堿(BER)、白屈菜紅堿(CHE)、氧化血根堿(OSA)、二氫血根堿(DHSA)、二氫白屈菜紅堿(DHCHE)等異喹啉類生物堿。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)博落回中某些生物堿(如血根堿、白屈菜紅堿、博落回總堿等)具有顯著的抗腫瘤作用[5-8]，可望發(fā)展成為一類高效的抗癌藥物，因而倍受人們關(guān)注。據(jù)國內(nèi)外有關(guān)博落回的研究結(jié)果可知：大多數(shù)研究集中在提取與分析博落回中總生物堿與4種主要生物堿[9-12]，而對于生物堿在博落回各器官中的分布、合成、代謝途徑以及基因的協(xié)同表達等研究甚少。由于生物堿成分與含量是博落回藥材質(zhì)量控制的主要指標，也是生物堿代謝組學(xué)的研究基礎(chǔ)，因而，這些研究對于博落回的品質(zhì)鑒定與資源利用具有重要意義。目前人們主要采取 HPLC和HPLC/MS來檢測博落回中主要生物堿的含量[13-14]，但由于博落回中已知的生物堿都屬于同源代謝途徑中的次生產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)均類似，因此，對博落回中生物堿的分離比較耗時，進行傳統(tǒng)的HPLC的全分析大多需要45 min以上，批量分析時溶劑的消耗很大，所需時間較多，且存在線性響應(yīng)較差、峰拖尾等問題。為了解決這些問題，本文作者研究一種超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-ESI-MS)快速測定博落回中8種主要生物堿含量的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器為：超高效液相色譜儀(Acquity UPLC，美國waters公司制造)；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer，美國 Waters公司制造)，工作軟件為MassLynx 4.1；超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司制造)；通用植物粉碎機(浙江瑞安制造)。

試劑為：乙腈，為色譜純(Merck公司生產(chǎn))；其他試劑，均為分析純。所有溶劑使用前均使用微孔濾膜過濾。

標準品中的鹽酸血根堿、鹽酸小檗堿和鹽酸白屈菜紅堿購于中國藥品生物制品檢定所，其余5種標準品(原阿片堿、別隱品堿、氧化血根堿、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿)由本實驗室自制，經(jīng)1HNMR和13CNMR鑒定后，再通過HPLC測定其質(zhì)量分數(shù)不低于99%。

1.2 實驗方法

取博落回全草5 kg。全草在溫度為50 ℃干燥箱中風干。準確稱取博落回根、莖、葉、果莢的干燥樣品(粉碎至粒度為0.25～0.38 μm)各2.0 g，分別放入4個具塞錐形瓶中，各加入 100 mL甲醇，在超聲清洗器(SB3200-T，50 kHz，250 W，必能信超聲(上海)有限公司制造)中連續(xù)超聲60 min后，放置冷卻至室溫，搖勻，用孔徑為0.2 μm的微孔濾膜濾取適量上清液，待測。

1.3 分離方法

稱取一定量的博落回果莢，用酸水滲漉提取，經(jīng)稀氨水堿化提取液后濾去沉淀。上清液經(jīng) AB-8大孔樹脂吸附、60%乙醇洗脫，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后再用高純度乙醇回流提取，過濾后將上清液保溫析晶。將析出的粗晶用葡聚糖凝膠分離，用等體積混合的氯仿-甲醇溶液洗脫，可分離出較多的別隱品堿晶體和另一種微量的白色晶體。經(jīng)核磁共振鑒定，該白色晶體為隱品堿。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

采用BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm，美國waters公司制造)；柱溫為30 ℃；流動相A為乙腈；流動相B是質(zhì)量分數(shù)為0.12%的甲酸水溶液，內(nèi)含15 mmol/L醋酸銨；梯度洗脫條件為：0～5 min，20%～50% A(體積分數(shù)，下同)，5.5～6.0 min，50%～55% A；6.0～6.5 min，55%～50% A；6.5～10.8 min，50%～63% A；10.8～11.0 min，63%～20% A。流速為0.25 mL/min；進樣量為 2 μL。

質(zhì)譜采用電噴霧電離(ESI)，全掃描模式，質(zhì)荷比為90～450。離子源參數(shù)如下：毛細管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為25 V (channel Ⅰ)和 55V (channel Ⅱ)；萃取電壓為4 V；源溫度為120 ℃；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氣流量為750 L/h；錐孔氣流量為50 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本實驗首先比較甲醇-水與乙腈-水2種流動相體系。發(fā)現(xiàn)乙腈-水體系比甲醇-水體系的壓力更小，且洗脫能力更強，能有效洗去BEH C18柱中雜質(zhì)殘留。其次研究以乙腈-氨水、乙腈-甲酸、乙腈-TFA(三氟乙酸)和乙腈-醋酸胺(加甲酸)等體系對于生物堿分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-TFA體系的分離效果最好，而乙腈-醋酸胺(加甲酸)體系次之，其余2種效果不太理想。究其原因可能是TFA與所測生物堿形成離子對增加了生物堿的保留時間，從而改善了被測物的分離效果。但由于TFA對生物堿的質(zhì)譜信號特別是對其中氧化血根堿的離子信號抑制作用過大，所以，最后選擇的流動相為乙腈-醋酸胺(加甲酸)體系。經(jīng)進一步實驗發(fā)現(xiàn)：使用該緩沖鹽體系也可有效增加生物堿在BEH C18柱中的保留時間，不僅目標峰分離度較大，且色譜峰形與其他體系相比也得到有效改善，滿足質(zhì)譜分析對緩沖鹽的使用要求；同時，甲酸的加入可增加離子化效率，有利于質(zhì)譜信號的加強。由于博落回中所含的生物堿在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有很多的相似性(見圖1)，等度洗脫很難將它們完全分開，因此，選擇分離效果較好的梯度洗脫方式。采用混標溶液考察色譜條件對各物質(zhì)分離度的影響，從而確定了 1.4節(jié)中所使用的梯度方案，在樣品的實測中分離效果良好。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在質(zhì)譜分析中，選擇電噴霧(ESI)電離模式分別對毛細管電壓、一級與二級錐孔電壓、源溫度、脫溶劑氣溫度等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，通過全掃描方式從總離子流圖(TIC)中分別找出 8種生物堿精確的分子離子峰，其中季胺堿型(SA，CHE和BER)選用[M]+作為母離子，叔胺堿型(PRO，ALL，DHSA，OSA和DHCHE)選用[M+H]+作為母離子。實驗結(jié)果表明：脫溶劑氣流量以及溫度對生物堿的離子化效率有較大影響。在0.25 mL/min的流速下不分流進樣時，通過調(diào)整霧化氣流量與溫度，觀察霧化情況，發(fā)現(xiàn)在脫溶劑氣流量為750 L/h、溫度為 350 ℃的情況下噴霧效果較好并且穩(wěn)定。

采用上述色譜條件對混標溶液和博落回根、莖、葉以及果莢的 UPLC-ESI/MS進行分析，檢測樣品的總離子流圖(ESI模式)，見圖2。樣品中8種生物堿含量根據(jù)標準品與樣品中對應(yīng)峰的保留時間與質(zhì)譜峰來確定(見表1)。結(jié)果表明：4個樣品與標準品的總離子流圖(TIC)和質(zhì)譜圖的對應(yīng)成分在保留時間、準分子離子和碎片離子峰等方面較吻合，重現(xiàn)性很好；與HPLC的分析時間相比，UPLC分析博落回果莢所需時間僅需11 min，約為同條件下HPLC全分析時間(45 min)的 1/4，且峰形更銳，靈敏度更高。這是因為 UPLC采用了小粒徑色譜填料(1.7 μm)的短柱，使得 UPLC在高壓、高流速下依然保持了良好的分離效率，從而節(jié)約了分析時間，實現(xiàn)了復(fù)雜物質(zhì)的快速分離。

2.3 方法的線性與回收率

分別配制系列濃度的混合標準品溶液，在最佳的分離條件下進行測定，以各化合物峰面積(y)對各生物堿質(zhì)量濃度(x)繪制工作曲線，回歸方程與相關(guān)系數(shù)見表2。以信噪比≥3作為檢出限，將標準儲備液逐級稀釋進樣，得各物質(zhì)的最低檢出限(表2)。結(jié)果表明：UPLC-ESI-MS方法可同時滿足博落回中 8種生物堿成分的定量檢測要求。

圖1 博落回中主要生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of main alkaloids in M.cordata.

2.4 方法的精密度與檢出限

精密稱取已測定含量的博落回果莢質(zhì)量，共 12份，每份1 g。將其中6份樣品分別加入0.5 mL混合標準品溶液，另外6份各加入1 mL混合標準品溶液，按加標試樣測定值與試樣測定值之差再與加標量之比計算回收率。對每個添加濃度重復(fù)6次實驗，計算加樣回收率和相對標準偏差，測定結(jié)果見表3。

2.5 博落回根、莖、葉與果莢的樣品分析

博落回全草中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的生物堿全部為異喹啉類生物堿，通?？煞譃?種類型：原阿片堿型(原阿片堿、別隱品堿和隱品堿等)、苯并菲啶型(血根堿和白屈菜紅堿等)、小檗堿型(小檗堿和黃連堿等)。這些異喹啉類生物堿在植物體內(nèi)的合成均起始于L-酪氨酸，經(jīng)過(S)-norcoclaurine 和(S)-scoulerine等共同的中間體，然后從(S)-scoulerine開始分成3條主要途徑，在不同的酶催化下合成博落回中其他各種生物堿[15-16]。雖然它們都是同源的次生代謝產(chǎn)物，但它們的生物活性與藥用效果差別很大，并且在博落回各器官中的分布也各不相同。中醫(yī)理論認為即使是同種的道地藥材，其用藥部位不同，療效差異顯著，因為不同部位的藥性與其有效成分的種類和含量密切相關(guān)。本研究中測定的8種生物堿都是藥理作用明確且在博落回各器官中含量較高的成分，因此，系統(tǒng)研究博落回各部位的生物堿成分與含量變化規(guī)律，不僅對博落回的資源利用很有價值，而且有利于中藥博落回及其制成品的質(zhì)量控制。

表1 8種生物堿的確定Table 1 Identification of eight alkaloids

表2 8種生物堿的回歸方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equation and coefficient of correlation in determination of eight alkaloids

表3 博落回果莢樣品分析的精密度與回收率(n=6)Table 3 Recovery and precision in determination of eight alkaloids from fruits of M.cordata (n=6)

采用提出的UPLC-ESI-MS方法，在1.4節(jié)的色譜條件下對博落回的根、莖、葉和果莢中8種生物堿質(zhì)量分數(shù)進行快速分析(見圖3)。結(jié)果表明：8種所測生物堿在博落回各部位的含量差別明顯，見圖3。由圖3可見：這8種生物堿在博落回各器官中均有分布，其中SA，CHE，PRO和ALL是各器官中的主要生物堿，含量比其他4種的含量要高很多。所測樣品中以博落回果莢所含總生物堿量最高(以8種生物堿計)，達4.89 mg/g，其中，SA質(zhì)量分數(shù)為1.79%，不僅是果莢中含量最高的生物堿，而且是該植物中含量最高的生物堿。同樣，CHE含量也以果莢為最高，達 0.7%，所以，果莢就成為博落回中獲取商品化的血根堿和白屈菜紅堿的最佳藥用部位。在博落回根中檢出最高含量的原阿片堿和別隱品堿，分別為 1.09%和 0.97%，其中別隱品堿含量明顯比其他幾個器官的堿含量高，但由于根是植物中相對不可再生的資源，所以，從根中提取別隱品堿并不是一種很好的選擇。葉中所含生物堿的含量也比較大，但由于博落回地上部分的采收期一般為11月左右，葉在這段時間已大多枯黃掉落，而提前采摘時，其他各部分的生物堿總量未達高值，所以，目前博落回葉子的利用尚不充分。通過比較圖3中的含量可知：莖中生物堿含量最低，其中4種主要生物堿含量中，SA為0.20%，CHE為0.17%，PRO為0.25%，ALL為 0.17%，但莖的干質(zhì)量占地上部分干質(zhì)量的70%～80%，所以，生物堿的總量也較大，可結(jié)合莖的特點在提取生物堿后對其綜合利用。在8種生物堿中，BER，OSA，DHSA和DHCHE在博落回各器官中的含量都比較低，提取與分離也很不容易，因此，需仔細分析微量生物堿含量，以便博落回資源的綜合開發(fā)與利用。

圖2 博落回中根、莖、葉和果莢的總離子流圖(TIC)Fig.2 UPLC-ESI-MS total ion current chromatogram of extract from four organs of M.cordat

2.6 隱品堿的分離與鑒定

通過樣品的TIC圖的分析，還在博落回的根和果莢中發(fā)現(xiàn)一定含量的隱品堿(保留時間tR為2.08 min)。它是別隱品堿的同分異構(gòu)體，其分子離子峰[M+H]+的相對分子質(zhì)量與別隱品堿的相同，與其他離子碎片不同，UPLC的出峰時間也有明顯區(qū)別，見圖4。胡之壁等[6]從博落回果實中分離并鑒定了α型和β型別隱品堿，并證實二者為2種物理異構(gòu)體，雖然晶形不同而熔點各異，但它們在氯仿溶液中的紅外光譜是完全一致的。然而，本文分離出的隱品堿不是別隱品堿的物理異構(gòu)體，而是它的化學(xué)異構(gòu)體。通過比較圖1中別隱品堿與隱品堿的分子結(jié)構(gòu)式可知：二者的分子結(jié)構(gòu)完全不同(僅相對分子質(zhì)量相同)，因此，隱品堿和別隱品堿互為化學(xué)異構(gòu)體。從圖4可見：當錐孔電壓為25 V時，隱品堿與別隱品堿都可以獲得高強度的分子離子峰([M+H]+質(zhì)荷比為 370)；而當錐孔電壓升高為55 V時，隱品堿獲得的強度最高的碎片峰質(zhì)荷比為204，但別隱品堿強度最高的碎片峰質(zhì)荷比為188。由此可見，根據(jù)二者在UPLC-ESI-MS分析中tR和質(zhì)譜碎片峰的差異，可以快速、簡單地鑒別出隱品堿與別隱品堿。

圖3 博落回的根、莖、葉和果莢中8種生物堿含量Fig.3 Contents of eight alkaloids from four organs of M.cordata

對提純后的隱品堿晶體采用1HNMR和13CNMR進行進一步驗證，所得結(jié)果如下：1HNMR (500 MHz，acetone)δ: 6.72 (1H, d,J= 7.8 Hz) C11-H; 6.66 (1H, d,J= 7.8 Hz) C12-H; 6.99 (1H, s) C1-H; 6.80 (1H, s) C4-H;5.94 (2H, s) -OCH2O-2，3；3.81(6H, s) -OCH3；1.88(3H,s)N-CH3; 3.59 (2H, br,) C8-H; 2.94 (2H, br,) C13-H; 2.79(2H, m,) C5-H; 2.50 (2H, br,) C6-H；13C-NMR (100 MHz,acetone)δ: 112.7(C-1)， 148.3(C-2)， 150.4(C-3)，114.9(C-4)，136.0(C-4a)，32.0(C-5)，58.69(C-6)，51.57(C-8)，132.3(C-8a)，146.7(C-9)，147.1(C-10)，106.9(C-11)，126.1(C-12)，119.4(C-12a)，47.16(C-13)，196.1(C-14)，132.0(C-14a)，56.0(2, -OCH3)，56.2(3,-OCH3)，41.7(-N-CH3)，101.7(-OCH2O-)。該結(jié)果與參考文獻[17]中隱品堿的結(jié)果相同。

圖4 隱品堿和別隱品堿的雙通道的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of Cryptopine and Allocryptopine on two channels

3 結(jié)論

(1) UPLC-ESI-MS方法具有快速分離與檢測的優(yōu)點，在11 min內(nèi)將待測成分完全分離，比常規(guī)HPLC的全分析速度提高了近3倍。該方法具有較高的準確度、精密度和較強穩(wěn)定性，適用于博落回樣品中生物堿的全分析。

(2) 博落回各器官中8種生物堿的含量差別很大，顯示博落回中3類異喹啉生物堿的代謝途徑與代謝方式各不相同，其中果莢為博落回根、莖、葉、果莢中生物堿含量最豐富的部位，血根堿為果莢中含量最高的生物堿成分。

(3) 從博落回果莢中分離并鑒定了隱品堿，通過質(zhì)譜和1HNMR和13CNMR證明隱品堿為別隱品堿的化學(xué)同分異構(gòu)體。

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