建立穩(wěn)定性指示性的分析方法在藥物分析領(lǐng)域的研究進(jìn)展

郝 福 胡向青

（以嶺醫(yī)藥集團(tuán)研究院，北京 101500）

穩(wěn)定性指示性的分析方法（Stability-indicating method）是指一種應(yīng)用于制藥工業(yè)中穩(wěn)定性樣品的測(cè)試方法，利用這類方法測(cè)定樣品能夠反映出在穩(wěn)定性試驗(yàn)條件下產(chǎn)品質(zhì)量的變化。FDA、ICH、EMEA等各類藥政部門都對(duì)該方法有嚴(yán)格的要求。這種方法因?yàn)榫哂辛己玫膶傩?，因此被廣泛地應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制、藥物的穩(wěn)定性研究、及體內(nèi)藥物分析等領(lǐng)域，本文綜述了這一方法在藥物分析領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 穩(wěn)定性指示性分析方法的各種法規(guī)要求

美國聯(lián)邦法典[1]21CFR 211.166（a）3要求“穩(wěn)定性測(cè)試方法應(yīng)該是一個(gè)可信賴的專屬性方法”。FDA“穩(wěn)定性試驗(yàn)研究指南（1998）”里指出[2]，對(duì)于已經(jīng)驗(yàn)證過的定量分析方法應(yīng)該具有良好的專屬性。ICH的Q1A（R2）里提到[3]，穩(wěn)定性測(cè)試的分析方法應(yīng)該經(jīng)過全面地驗(yàn)證并且具有穩(wěn)定性指示性的特點(diǎn)。ICH的Q2A和Q3B里要求[4,5]，對(duì)于藥物的含量測(cè)定和雜質(zhì)（或降解產(chǎn)物）測(cè)定，需要建立并驗(yàn)證一個(gè)穩(wěn)定性指示性的分析方法。

建立科學(xué)的穩(wěn)定性指示性方法，對(duì)于制藥研發(fā)部門來說，它不僅可以間接地為患者提供了安全有效、穩(wěn)定的產(chǎn)品，而且可以降低商業(yè)運(yùn)作過程中的風(fēng)險(xiǎn)，樹立制藥企業(yè)的聲譽(yù)。

2 建立穩(wěn)定性指示性分析方法的技術(shù)要求

隨著科技的進(jìn)步和科研實(shí)力的提高，多種先進(jìn)的分析手段被應(yīng)用到藥物分析領(lǐng)域，如HPLC、UPLC、GC、CE等，這些方法都是基于各種分離機(jī)理設(shè)計(jì)的，廣泛地收載于各國藥典；另外一些方法，如紫外/可見分光光度法、比色法、衍生化法、滴定法等，這些方法專屬性較差，因此實(shí)際應(yīng)用經(jīng)常受到限制。

各種法規(guī)對(duì)于“穩(wěn)定性指示性方法”的解釋都強(qiáng)調(diào)了一個(gè)詞匯“專屬性”，通常采用以下幾種手段達(dá)到判斷方法專屬性的目的：①降解研究，即樣品經(jīng)過放置在強(qiáng)力破壞的試驗(yàn)條件下測(cè)定，如光、熱、濕、酸堿水解及氧化條件，降解試驗(yàn)?zāi)茉诤艽蟪潭壬蠈?duì)分析方法的專屬性進(jìn)行驗(yàn)證。②考察臨界分離度，即用兩個(gè)洗脫程度最接近的化合物的分離度來證明其專屬性。③在空白基質(zhì)或輔料中定量地加入主成分或雜質(zhì)，與未添加的樣品測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較，以證明其測(cè)定結(jié)果不受這些物質(zhì)的影響。

檢索國內(nèi)外相關(guān)的指導(dǎo)原則，未見對(duì)強(qiáng)制降解試驗(yàn)的具體試驗(yàn)條件作明確的規(guī)定。本文在檢索相關(guān)資料[6-9]的基礎(chǔ)上，歸納了強(qiáng)制降解試驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目與部分試驗(yàn)條件，見表1。

每種試驗(yàn)條件均需要平行制備空白溶劑對(duì)照、空白輔料對(duì)照或其他質(zhì)控樣品，以判斷所產(chǎn)生的降解物質(zhì)或未知峰的來源。在設(shè)計(jì)各項(xiàng)目的具體試驗(yàn)條件時(shí)，應(yīng)結(jié)合藥物的劑型、工藝條件等進(jìn)行綜合考慮，掌握合適的強(qiáng)制降解試驗(yàn)程度，一般控制主成分降解5%～10%為最佳破壞條件；對(duì)于用色譜理論建立的測(cè)試方法，還需要計(jì)算破壞后整個(gè)物質(zhì)的回收率，即物料平衡，回收率應(yīng)達(dá)到95%～105%，避免因?yàn)闄z測(cè)系統(tǒng)選擇不佳導(dǎo)致部分雜質(zhì)/降解產(chǎn)物漏檢的問題。對(duì)于破壞性試驗(yàn)中產(chǎn)生的較大降解產(chǎn)物，必要時(shí)進(jìn)行定性分析。

表1 典型的原料藥/制劑降解研究的試驗(yàn)條件

建立穩(wěn)定性指示性方法，主要有以下幾個(gè)步驟[6-9,14]：①首先剖析待分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，評(píng)估可能的降解途徑；從化學(xué)結(jié)構(gòu)可以獲得很多信息，功能基的種類可以預(yù)測(cè)化合物的穩(wěn)定性及溶解性等，如酰胺、酯、內(nèi)酰胺、內(nèi)酯都容易水解，硫醇、硫醚容易被氧化等。②收集化合物的物理、化學(xué)信息，如溶解性、pKa、logP、最大吸收波長、晶形、熱穩(wěn)定性、原輔料相容性等；③開展降解研究，利用降解研究的樣品開展初步的分離試驗(yàn)；對(duì)于液相色譜，利用PDA檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器可以評(píng)價(jià)峰純度。④方法的最終建立和優(yōu)化；⑤對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，制備雜質(zhì)對(duì)照品；質(zhì)譜技術(shù)在藥物降解產(chǎn)物或代謝物的定性、定量研究中日益發(fā)揮著越來越重要的作用。

3 對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證

對(duì)于不同類型的分析方法有不同的驗(yàn)證要求，美國藥典將分析方法分為4類，對(duì)每一種類型的方法都提供了要求[10]，見表2。

4 穩(wěn)定性指示性分析方法在藥物分析中的應(yīng)用

4.1 穩(wěn)定性指示性HPTLC法的應(yīng)用進(jìn)展

HPTLC法（高效薄層色譜法）是將傳統(tǒng)的薄層色譜法儀器化，采用高效薄層板和高質(zhì)量的薄層掃描儀，大大提高了薄層板的分離能力和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。

Faiyazuddin等[11]建立了具有穩(wěn)定性指示性的HPTLC法測(cè)定硫酸特布他林原料藥及制劑產(chǎn)品中的含量，作者考察了硫酸特布他林在酸、堿、氧化、光照條件下各斑點(diǎn)的分離情況，結(jié)果各降解產(chǎn)物與主成分分離度均良好。Mostafa等[12]建立了穩(wěn)定性指示性的薄層色譜掃描法測(cè)定撲熱息痛原料藥和制劑的含量，結(jié)果，撲熱息痛的Rf值為0.32，其它兩個(gè)降解產(chǎn)物的Rf分別為0.45和0.76。EI-Saharty等[13]建立并驗(yàn)證了測(cè)定鹽酸匹哌氮酯原料藥含量的薄層掃描法，結(jié)果該方法可以特異性地檢測(cè)在有堿降解產(chǎn)物存在的條件下鹽酸匹哌氮酯的含量，鹽酸匹哌氮酯和其堿降解產(chǎn)物的Rf值分別為0.28和0.51。

表2 分析方法驗(yàn)證指標(biāo)的要求

HPTLC法可以使用少量的溶劑同時(shí)運(yùn)行多個(gè)樣品，分析效率較高，但是因?yàn)樵摲椒ㄈ狈?yōu)良的檢測(cè)限、變異性、重復(fù)性，今后的應(yīng)用還需加強(qiáng)研究，然而，該方法非常適宜于藥物的初始降解研究，它配合HPLC可以跟蹤降解產(chǎn)物的個(gè)數(shù)，并適量分離制備一些雜質(zhì)[14]。

4.2 穩(wěn)定性指示性HPLC/UPLC法的應(yīng)用進(jìn)展

HPLC法具有分析準(zhǔn)確度好、選擇好、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，不論藥物極性的大小，熱穩(wěn)定性好壞等都可以使用HPLC法檢測(cè)，因此該法廣泛地應(yīng)用于藥物雜質(zhì)及降解物的分析檢測(cè)。

Kasawar等[15]建立了穩(wěn)定性指示性的HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方硫酸沙丁胺醇和異丙托溴銨鼻噴劑中的有關(guān)物質(zhì)，該方法采用梯度洗脫，使用峰純度指數(shù)評(píng)價(jià)降解研究中雜質(zhì)的分離情況，并系統(tǒng)考察了方法的耐用性情況。Srinivasu等[16]建立并驗(yàn)證了穩(wěn)定性指示性的梯度HPLC法，該方法可以特異性地檢測(cè)乙酰唑胺及其有關(guān)物質(zhì)。作者研究了各種強(qiáng)制條件下雜質(zhì)分離和檢出情況，對(duì)含量較大的降解產(chǎn)物采用LCMS、FTIR and 1H/13C NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果，該方法對(duì)乙酰唑胺與其4個(gè)已知雜質(zhì)及降解產(chǎn)物間的分離度都不低于2.0。Rao等[17]建立并驗(yàn)證了用于測(cè)定原料藥及制劑中硫酸氫氯吡格雷片及其有關(guān)物質(zhì)的正相HPLC法，該方法能夠分離所有已知雜質(zhì)包括異構(gòu)體雜質(zhì)。

UPLC因?yàn)榫哂蟹治鏊俣瓤欤蛛x效率高的優(yōu)點(diǎn)已逐漸進(jìn)入藥品質(zhì)量控制領(lǐng)域。Lakshmi Narasimham等[18]建立并驗(yàn)證了一個(gè)可以同時(shí)檢測(cè)β受體阻斷劑和利尿藥的UPLC法，所有化合物在3.3min內(nèi)都達(dá)到了很好的分離，堿降解研究結(jié)果表明，2種新降解產(chǎn)物都用UPLC/MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，該方法按照ICH指南進(jìn)行了系統(tǒng)的方法驗(yàn)證。

綜上所述，在藥品的雜質(zhì)控制上，穩(wěn)定性指示性HPLC法被廣泛應(yīng)用，多組分同時(shí)檢測(cè)、特殊色譜柱的使用、PDA檢測(cè)器的推廣使用、系統(tǒng)深入的降解研究是今后穩(wěn)定性指示性HPLC法發(fā)展的共同趨勢(shì)。

4.3 穩(wěn)定性指示性GC法的應(yīng)用進(jìn)展

GC作為穩(wěn)定性指示性的方法有它的使用局限性，它要求藥物容易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性要好；有時(shí)為了增加藥物的可揮發(fā)性而選擇升高溫度，將導(dǎo)致某些物質(zhì)的降解或再次降解。因此，僅有少量的文獻(xiàn)報(bào)道[19,20]使用GC法用于藥物的含量或雜質(zhì)的測(cè)定。

4.4 穩(wěn)定性指示性CE法的應(yīng)用進(jìn)展

毛細(xì)管電泳（CE）是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)，具有高靈敏度、高速度、高分辨率、所需樣品少、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

Baalbaki等[21]建立并驗(yàn)證了用于測(cè)定異西噴地軟膏含量的穩(wěn)定性指示性的區(qū)帶毛細(xì)管電泳法，藥物和內(nèi)標(biāo)物在3min內(nèi)分析完畢，檢測(cè)限度為0.5mg/L。Hamdan等[22]建立并驗(yàn)證了測(cè)定鹽酸二甲雙胍片含量的穩(wěn)定性指示性的CE法，通過降解研究結(jié)合峰純度評(píng)價(jià)，建立了該方法的穩(wěn)定性指示性的能力。Alnajjar等[23]建立并驗(yàn)證了測(cè)定諾氟沙星及其脫羧降解產(chǎn)物含量的穩(wěn)定性指示性的CE法，對(duì)于這兩個(gè)化合物，分析方法的線性范圍較寬，能夠達(dá)到0.11mg/L的檢測(cè)限度。中草藥的質(zhì)量控制中也常常用到穩(wěn)定性指示性的CE法，Song等[24]建立并驗(yàn)證了毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定附子中的6種生物堿含量，通過篩選緩沖溶液體系、pH、有機(jī)改性劑、高氯酸的濃度等因素建立了分析方法，并且利用酸、堿、氧化等強(qiáng)制降解因素優(yōu)化了分析方法。

4.5 其他方法

E1-Bardidy等[25]建立了電化學(xué)分析法同時(shí)測(cè)定對(duì)氯苯氧乙酸二甲胺基乙酯鹽酸鹽和吡硫醇二鹽酸鹽一水化物的含量，通過降解試驗(yàn)和HPTLC法制備了降解產(chǎn)物，考察了方法的專屬性。Badawy等[26]研究了他扎羅汀的穩(wěn)定性并且建立了兩種穩(wěn)定性指示性的分析方法—一階導(dǎo)數(shù)分光光度法和比光譜導(dǎo)數(shù)法，這種方法可以在有其堿性降解產(chǎn)物存在的情況下測(cè)定他扎羅汀的含量。

5 展 望

FDA在藥品注冊(cè)申報(bào)的批準(zhǔn)前現(xiàn)場(chǎng)檢查中，經(jīng)常審核分析方法的專屬性問題。檢索FDA網(wǎng)站關(guān)于“穩(wěn)定性指示性分析方法”的缺陷信[27]，結(jié)果從2001至2010年，共有33份警告信；從2009年至2010年，共10份，結(jié)果體現(xiàn)了藥政部門對(duì)今后分析方法的審核越來越嚴(yán)格。藥品質(zhì)量控制理念在逐步提升，從“藥品質(zhì)量是檢驗(yàn)出來的”到“藥品質(zhì)量是生產(chǎn)出來”，再到“藥品質(zhì)量是設(shè)計(jì)出來的”這一核心轉(zhuǎn)變，伴隨著新儀器、新技術(shù)的產(chǎn)生，穩(wěn)定性指示性藥物分析方法的應(yīng)用步入了新的階段，快速、高專屬性、高選擇性、高樣品處理能力是今后這一領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。

[1]Code of Federal Regulations,Title 21,Volume 4,Revised as of April 1,2010.

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