長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因部分序列克隆及表達(dá)分析

胡華軍，薩曉嬰，應(yīng)華忠，劉 軍，馮丁丁，殷楠楠

（1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 杭州 310013；3.浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白1（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，TIM－1），是一種I型跨膜蛋白，由N末端免疫球蛋白可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域（IgV）、黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和一個(gè)帶有磷酸化基序的胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成［1］.TIM－1表達(dá)于活化的初始T細(xì)胞、Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NTK細(xì)胞表面，作為受體蛋白與天然內(nèi)源性配體TIM－1、TIM－4、磷脂酰絲氨酸（PtdSer）、IgA、白細(xì)胞單型免疫球蛋白樣受體5（LMIR5／C300b）等相互作用，為細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子分泌，介導(dǎo)對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬和清除［2］.尤其Tim－1對(duì)Th2細(xì)胞的偏向性作用直接影響過(guò)敏性疾病的發(fā)生與發(fā)展.另外，由于Tim－1最早是作為甲型肝炎病毒（HAV）感染細(xì)胞的結(jié)合受體而被發(fā)現(xiàn)的，又稱(chēng)HAVcr－1.在流行病學(xué)研究中，McIntire等發(fā)現(xiàn)人類(lèi)TIM－1基因157insMTTTVP型個(gè)體感染HAV后可降低患過(guò)敏性疾病風(fēng)險(xiǎn)［3］.而隨后研究者們相繼對(duì)不同國(guó)家人群TIM－1基因外顯子4及啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)的變異與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性濕疹、哮喘等疾病進(jìn)行相關(guān)性研究，但結(jié)論不一，其原因可能是各地人群受遺傳背景、生活環(huán)境、HAV感染幾率等不同因素的影響［4］.因此 HAV、Tim－1、哮喘等過(guò)敏性疾病的功能聯(lián)系有待深入研究，但目前還缺乏理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型.長(zhǎng)爪沙鼠又稱(chēng)沙土鼠（Meriones unguiculatus）、蒙古沙鼠（Mongolian gerbils），隸屬?lài)X目，倉(cāng)鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬，是一種正在被開(kāi)發(fā)的“多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”［5］.本研究目的在于獲得長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因編碼區(qū)部分序列，并建立熒光定量PCR方法檢測(cè)Tim－1基因在不同組織中表達(dá)情況.

1 材料與方法

1.1 材料

TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Pyrobest DNA Polymerase、M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBGreen熒光試劑盒、RNase Inhibitor和pMD18－T載體購(gòu)自寶生物工程公司；E.coli DH5α感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表1.ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠（6－8周齡雄性），由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（浙）2003－0002］，采集的肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟組織凍存于液氮中.

1.2 長(zhǎng)爪沙鼠各組織總RNA的提取與cDNA的合成

手術(shù)剪準(zhǔn)確剪取ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟7個(gè)不同組織，生理鹽水洗凈后用TRIzol試劑提取各組織總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)其OD值，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，按M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.存于－70℃?zhèn)溆?

1.3 PCR及產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

根據(jù)對(duì)GenBank中小鼠的 Tim－1（NM＿001166631）、大鼠的Tim－1（NM＿173149.1）的序列分析，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1的一個(gè)正向簡(jiǎn)并引物（gTIM－1－F1）和兩個(gè)反向簡(jiǎn)并引物（gTIM－1－R1、gTIM－1－R2）（表1）.將合成的cDNA為模板，利用gTIM－1－F1、gTIM－1－R1為外側(cè)引物，gTIM－1－F1、gTIM－1－R2為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1的同源片段.兩輪PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2min.將獲得的第二輪PCR產(chǎn)物切膠回收，連入pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，PCR法篩選陽(yáng)性菌株，將篩選菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.

表1 Tim－1基因克隆的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for cloning of Tim－1gene.

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因的不同組織中表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測(cè)長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因在肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟組織中的表達(dá)情況.根據(jù)所克隆的長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1的基因片段序列設(shè)計(jì)引物gTIM－1－P1、gTIM－1－P2（表1），根據(jù)GenBank中報(bào)道的長(zhǎng)爪沙鼠β－肌動(dòng)蛋白（ACTIN－β，AB177844.1）保守序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物gACTIN－β－P3、gACTIN－β－P4（表1）.將提取各組織總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，采用SYBGreen染料法進(jìn)行Real－Time PCR反應(yīng)，PCR條件：95℃10s預(yù)變性；95℃變性，5s，60℃25s退火／延伸（收集熒光信號(hào)），45循環(huán)，在55－95℃之間制備融解曲線(xiàn)確定Tim－1基因擴(kuò)增特異性.內(nèi)參基因ACTIN－β和目的基因Tim－1在同一條件下不同管內(nèi)擴(kuò)增，試驗(yàn)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，最后取平均值.采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量.并將長(zhǎng)爪沙鼠脾臟組織定義為對(duì)照，分析其他組織相對(duì)脾臟組織的Tim－1表達(dá)水平差異.

2 結(jié) 果

2.1 長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因片段克隆與序列比對(duì)

設(shè)計(jì)的Tim－1基因引物在長(zhǎng)爪沙鼠腎組織中得到了較好的擴(kuò)增（圖1），測(cè)序發(fā)現(xiàn)Tim－1基因擴(kuò)增片段為243bp，序列同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該片段與小鼠、大鼠Tim－1基因相似性（similarity）達(dá)80%以上，推斷所獲得的cDNA為T(mén)im－1基因的部分片段（圖2）.該序列已提交到GenBank，登錄號(hào)為JN628997.

圖1 Tim－1基因部分片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖Figure 1 PCR amplification of Tim－1gene

圖2 長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因克隆片段與小鼠、大鼠Tim－1基因序列的同源性比較Figure 2 Homology comparison of Tim－1sequences in Meriones unguiculatus，mouse and rat

2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性

對(duì)樣品Tim－1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在55～95℃進(jìn)行了融解曲線(xiàn)分析，每隔0.2℃讀板1次.根據(jù)對(duì)原始曲線(xiàn)（圖3a）和融解曲線(xiàn)（圖3b）分析得Tm值為81.8℃，融解曲線(xiàn)都為單峰，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增效果特異性好.

2.3 長(zhǎng)爪沙鼠不同組織Tim－1基因mRNA表達(dá)的比較

圖3 Tim－1基因的熔解曲線(xiàn)Figure 3 Melting curve of Tim－1gene

每一組織樣品均使用β－肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參照，并定義在長(zhǎng)爪沙鼠脾臟組織中的表達(dá)水平為1，以對(duì)Tim－1基因在其它組織樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），Tim－1基因在長(zhǎng)爪沙鼠肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟組織中表達(dá)具有差異性，在腎臟組織中表達(dá)水平高于其他組織，在小腸、脾臟、肺組織中表達(dá)較低，在肌肉、心臟和肝組織中表達(dá)更低.

圖4 Tim－1mRNA在長(zhǎng)爪沙鼠不同組織中表達(dá)Figure 4 Expression of Tim－1mRNA in different tissues of Meriones unguiculatus

3 討 論

目前對(duì)于哮喘等過(guò)敏性疾病的研究往往通過(guò)建立與人類(lèi)似癥狀的動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行.已開(kāi)展的哮喘動(dòng)物模型種類(lèi)較多，包括猴、馬、豬、貓、犬、羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠，其中鼠類(lèi)應(yīng)用最普遍，但都有不足之處［6，7］.如豚鼠雖易被致敏，能產(chǎn)生I型變態(tài)反應(yīng)，反應(yīng)程度強(qiáng)于其他動(dòng)物，但個(gè)體差異較大，且其變態(tài)反應(yīng)更多由IgG而非IgE介導(dǎo)，這與人類(lèi)的有所不同，且試驗(yàn)中死亡率較高［6］；大鼠、小鼠雖然遺傳背景較為清楚，制作哮喘模型時(shí)死亡率低，但臨床指征不明顯；小鼠由于體積小，操作不便，也易造成非哮喘性氣道阻力增高［7］.同時(shí)還因?yàn)樾∈髮?duì)HAV不易感，不適用于研究人類(lèi)哮喘與HAV關(guān)系的動(dòng)物模型［8］.此外，對(duì)于貓、兔、羊、豬、犬、猴等用于制作哮喘模型時(shí)同樣有不足，加之價(jià)格較昂貴也限制了其應(yīng)用.因此有必要尋找新動(dòng)物模型用于HAV、TIM－1及哮喘等過(guò)敏性疾病互作關(guān)系的研究.長(zhǎng)爪沙鼠曾是研究流行性出血熱病毒（EHFV）特性和研制流行性出血熱疫苗的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［9］；也是研究脂類(lèi)代謝、絲蟲(chóng)病與線(xiàn)蟲(chóng)病等寄生蟲(chóng)病、糖尿病、自發(fā)性癲癇等的理想動(dòng)物模型.隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，長(zhǎng)爪沙鼠被廣泛地用于藥理學(xué)、血清學(xué)和細(xì)菌學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、行為學(xué)等研究領(lǐng)域［10］.本研究中我們首次克隆獲得了長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因部分片段，并檢測(cè)出不同組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征，從而為克隆長(zhǎng)爪沙鼠Tim－1基因全長(zhǎng)cDNA序列及探討建立與TIM－1功能關(guān)聯(lián)動(dòng)物模型的研究提供了遺傳背景方面信息.

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