長爪沙鼠Tim－1基因部分序列克隆及表達分析

胡華軍，薩曉嬰，應華忠，劉 軍，馮丁丁，殷楠楠

（1.中國計量學院 生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.浙江省醫(yī)學科學院 實驗動物中心，浙江 杭州 310013；3.浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018）

T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白1（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，TIM－1），是一種I型跨膜蛋白，由N末端免疫球蛋白可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域（IgV）、黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和一個帶有磷酸化基序的胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成［1］.TIM－1表達于活化的初始T細胞、Th2細胞、肥大細胞、NTK細胞表面，作為受體蛋白與天然內(nèi)源性配體TIM－1、TIM－4、磷脂酰絲氨酸（PtdSer）、IgA、白細胞單型免疫球蛋白樣受體5（LMIR5／C300b）等相互作用，為細胞活化提供協(xié)同刺激信號，促進相關細胞因子分泌，介導對凋亡細胞的吞噬和清除［2］.尤其Tim－1對Th2細胞的偏向性作用直接影響過敏性疾病的發(fā)生與發(fā)展.另外，由于Tim－1最早是作為甲型肝炎病毒（HAV）感染細胞的結(jié)合受體而被發(fā)現(xiàn)的，又稱HAVcr－1.在流行病學研究中，McIntire等發(fā)現(xiàn)人類TIM－1基因157insMTTTVP型個體感染HAV后可降低患過敏性疾病風險［3］.而隨后研究者們相繼對不同國家人群TIM－1基因外顯子4及啟動子區(qū)位點的變異與類風濕關節(jié)炎、過敏性濕疹、哮喘等疾病進行相關性研究，但結(jié)論不一，其原因可能是各地人群受遺傳背景、生活環(huán)境、HAV感染幾率等不同因素的影響［4］.因此 HAV、Tim－1、哮喘等過敏性疾病的功能聯(lián)系有待深入研究，但目前還缺乏理想的實驗動物模型.長爪沙鼠又稱沙土鼠（Meriones unguiculatus）、蒙古沙鼠（Mongolian gerbils），隸屬嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬，是一種正在被開發(fā)的“多功能實驗動物”［5］.本研究目的在于獲得長爪沙鼠Tim－1基因編碼區(qū)部分序列，并建立熒光定量PCR方法檢測Tim－1基因在不同組織中表達情況.

1 材料與方法

1.1 材料

TRIzol試劑購自Invitrogen公司；Pyrobest DNA Polymerase、M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBGreen熒光試劑盒、RNase Inhibitor和pMD18－T載體購自寶生物工程公司；E.coli DH5α感受態(tài)為本實驗室保存；引物由上海生物工程公司合成，引物序列見表1.ZCLA長爪沙鼠（6－8周齡雄性），由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供［SCXK（浙）2003－0002］，采集的肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟組織凍存于液氮中.

1.2 長爪沙鼠各組織總RNA的提取與cDNA的合成

手術(shù)剪準確剪取ZCLA長爪沙鼠肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟7個不同組織，生理鹽水洗凈后用TRIzol試劑提取各組織總RNA，分光光度計檢測其OD值，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.存于－70℃?zhèn)溆?

1.3 PCR及產(chǎn)物的克隆與測序

根據(jù)對GenBank中小鼠的 Tim－1（NM＿001166631）、大鼠的Tim－1（NM＿173149.1）的序列分析，我們設計合成了長爪沙鼠Tim－1的一個正向簡并引物（gTIM－1－F1）和兩個反向簡并引物（gTIM－1－R1、gTIM－1－R2）（表1）.將合成的cDNA為模板，利用gTIM－1－F1、gTIM－1－R1為外側(cè)引物，gTIM－1－F1、gTIM－1－R2為內(nèi)側(cè)引物進行半巢式PCR擴增長爪沙鼠Tim－1的同源片段.兩輪PCR反應條件如下：94℃預變性4min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共34個循環(huán)；最后72℃延伸2min.將獲得的第二輪PCR產(chǎn)物切膠回收，連入pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，PCR法篩選陽性菌株，將篩選菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序.

表1 Tim－1基因克隆的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for cloning of Tim－1gene.

1.4 實時熒光定量PCR檢測長爪沙鼠Tim－1基因的不同組織中表達

采用熒光定量PCR檢測長爪沙鼠Tim－1基因在肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟組織中的表達情況.根據(jù)所克隆的長爪沙鼠Tim－1的基因片段序列設計引物gTIM－1－P1、gTIM－1－P2（表1），根據(jù)GenBank中報道的長爪沙鼠β－肌動蛋白（ACTIN－β，AB177844.1）保守序列設計內(nèi)參引物gACTIN－β－P3、gACTIN－β－P4（表1）.將提取各組織總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應后，采用SYBGreen染料法進行Real－Time PCR反應，PCR條件：95℃10s預變性；95℃變性，5s，60℃25s退火／延伸（收集熒光信號），45循環(huán)，在55－95℃之間制備融解曲線確定Tim－1基因擴增特異性.內(nèi)參基因ACTIN－β和目的基因Tim－1在同一條件下不同管內(nèi)擴增，試驗對每個樣品進行3個技術(shù)重復，最后取平均值.采用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達量.并將長爪沙鼠脾臟組織定義為對照，分析其他組織相對脾臟組織的Tim－1表達水平差異.

2 結(jié) 果

2.1 長爪沙鼠Tim－1基因片段克隆與序列比對

設計的Tim－1基因引物在長爪沙鼠腎組織中得到了較好的擴增（圖1），測序發(fā)現(xiàn)Tim－1基因擴增片段為243bp，序列同源比對分析發(fā)現(xiàn)該片段與小鼠、大鼠Tim－1基因相似性（similarity）達80%以上，推斷所獲得的cDNA為Tim－1基因的部分片段（圖2）.該序列已提交到GenBank，登錄號為JN628997.

圖1 Tim－1基因部分片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖Figure 1 PCR amplification of Tim－1gene

圖2 長爪沙鼠Tim－1基因克隆片段與小鼠、大鼠Tim－1基因序列的同源性比較Figure 2 Homology comparison of Tim－1sequences in Meriones unguiculatus，mouse and rat

2.2 熒光定量PCR擴增產(chǎn)物特異性

對樣品Tim－1基因的擴增產(chǎn)物在55～95℃進行了融解曲線分析，每隔0.2℃讀板1次.根據(jù)對原始曲線（圖3a）和融解曲線（圖3b）分析得Tm值為81.8℃，融解曲線都為單峰，說明所設計的引物擴增效果特異性好.

2.3 長爪沙鼠不同組織Tim－1基因mRNA表達的比較

圖3 Tim－1基因的熔解曲線Figure 3 Melting curve of Tim－1gene

每一組織樣品均使用β－肌動蛋白基因作為內(nèi)參照，并定義在長爪沙鼠脾臟組織中的表達水平為1，以對Tim－1基因在其它組織樣品中的表達水平進行相對定量.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），Tim－1基因在長爪沙鼠肌肉、心臟、小腸、脾臟、肝臟、肺、腎臟組織中表達具有差異性，在腎臟組織中表達水平高于其他組織，在小腸、脾臟、肺組織中表達較低，在肌肉、心臟和肝組織中表達更低.

圖4 Tim－1mRNA在長爪沙鼠不同組織中表達Figure 4 Expression of Tim－1mRNA in different tissues of Meriones unguiculatus

3 討 論

目前對于哮喘等過敏性疾病的研究往往通過建立與人類似癥狀的動物模型來進行.已開展的哮喘動物模型種類較多，包括猴、馬、豬、貓、犬、羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠，其中鼠類應用最普遍，但都有不足之處［6，7］.如豚鼠雖易被致敏，能產(chǎn)生I型變態(tài)反應，反應程度強于其他動物，但個體差異較大，且其變態(tài)反應更多由IgG而非IgE介導，這與人類的有所不同，且試驗中死亡率較高［6］；大鼠、小鼠雖然遺傳背景較為清楚，制作哮喘模型時死亡率低，但臨床指征不明顯；小鼠由于體積小，操作不便，也易造成非哮喘性氣道阻力增高［7］.同時還因為小鼠對HAV不易感，不適用于研究人類哮喘與HAV關系的動物模型［8］.此外，對于貓、兔、羊、豬、犬、猴等用于制作哮喘模型時同樣有不足，加之價格較昂貴也限制了其應用.因此有必要尋找新動物模型用于HAV、TIM－1及哮喘等過敏性疾病互作關系的研究.長爪沙鼠曾是研究流行性出血熱病毒（EHFV）特性和研制流行性出血熱疫苗的首選實驗動物［9］；也是研究脂類代謝、絲蟲病與線蟲病等寄生蟲病、糖尿病、自發(fā)性癲癇等的理想動物模型.隨著現(xiàn)代醫(yī)學的飛速發(fā)展，長爪沙鼠被廣泛地用于藥理學、血清學和細菌學、內(nèi)分泌學、行為學等研究領域［10］.本研究中我們首次克隆獲得了長爪沙鼠Tim－1基因部分片段，并檢測出不同組織轉(zhuǎn)錄表達特征，從而為克隆長爪沙鼠Tim－1基因全長cDNA序列及探討建立與TIM－1功能關聯(lián)動物模型的研究提供了遺傳背景方面信息.

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