血卟啉對(duì)人胰腺癌細(xì)胞Panc－1的光動(dòng)力作用及機(jī)制*

于 鐘， 鐘 娃， 袁宇紅， 陳其奎， 朱兆華△， 張晉昕

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化科，廣東 廣州 510120;2中山大學(xué)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)與流行病學(xué)系，廣東 廣州 510080)

迄今為止，胰腺癌仍是所有常見惡性腫瘤中生存率最低者，僅10%的患者在就診時(shí)有手術(shù)機(jī)會(huì)［1］，對(duì)無法手術(shù)的患者，可能有效的措施是化療、放療或二者的結(jié)合。目前總的1年生存率不超過10%［2］，新治療方法仍亟待解決。

光動(dòng)力治療(photodynamic therapy，PDT)是二十世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種腫瘤治療新方法，其原理是利用光敏劑能夠選擇性聚集在腫瘤組織中，然后用特定波長的激光激發(fā)光敏劑，使其產(chǎn)生光化學(xué)和光生物學(xué)反應(yīng)，破壞腫瘤組織［3］。本研究以人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌Panc－1細(xì)胞系為對(duì)象，系統(tǒng)觀察了光敏劑Photosan(即血卟啉，hematoporphyrin)PDT對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，并探討其主要作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑及儀器

人胰腺癌細(xì)胞系Panc－1購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，并由我院醫(yī)學(xué)研究中心凍存。Photosan凍干粉針(145 mg/支，購自 SeeLab);CCK－8(Cell Counting Kit－8，日本同仁化學(xué)研究所);活性氧檢測試劑盒、細(xì)胞壞死與凋亡檢測試劑盒(均購自碧云天生物技術(shù)研究所);兔抗鼠活性caspase－3多克隆抗體(Abcam)。Biolitec PDT 630半導(dǎo)體激光治療儀(CeramOptec GmbH);流式細(xì)胞儀 (FACS Calibur，Becton Dickinson);組合式熒光壽命與穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器公司)。

2 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1的體外培養(yǎng)

參照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)［4］介紹的方法進(jìn)行。Panc－1細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后在RPMI－1640完全培養(yǎng)基(含青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L、10%新鮮胎牛血清)中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)密度為(1－2)×109/L，每3－4 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。

3 光敏劑Photosan溶液的準(zhǔn)備

每于實(shí)驗(yàn)前根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需稱取Photosan凍干粉，用不含血清的RPMI－1640培養(yǎng)基配制成不同濃度的溶液，保存于4℃?zhèn)溆?。所有操作過程及保存均在避光條件下進(jìn)行。

4 光敏劑Photosan對(duì)Panc－1細(xì)胞的PDT作用

4.1 PDT 配制光敏劑為如下濃度:0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 mg/L，并設(shè)不加光敏劑的空白對(duì)照(0 mg/L)。設(shè)光照劑量如下:1、5、10、15、20、25、30 J/cm2，并設(shè)不予照射的空白對(duì)照(0 J/cm2)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。調(diào)整Panc－1細(xì)胞密度為5×107/L，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。更換細(xì)胞培養(yǎng)基為上述各種濃度的光敏劑100 μL/well，培養(yǎng)8 h。再更換光敏劑溶液為不含血清的培養(yǎng)基100 μL/well，立即給予激光照射，波長630 nm、光斑直徑5 cm。為避免光線散射或反射的影響，每板只接受1次激光照射。照射完畢，所有96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4.2 PDT后CCK－8實(shí)驗(yàn)測定Panc－1細(xì)胞活性(1)原理:CCK－8試劑中含有WST－8，它在電子載體1－methoxy PMS的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜染料。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以酶標(biāo)儀檢測其吸光度進(jìn)行細(xì)胞毒性分析［5］。(2)方法:取出所有96孔板，每孔加入10 μL的CCK－8，輕微振蕩混勻10 min，置培養(yǎng)箱孵育4 h后取出，以酶標(biāo)儀檢測各組各孔吸光度值，每板用一空白孔調(diào)零。檢測波長為450 nm，參比波長為630 nm。各組吸光度(A450)可以轉(zhuǎn)換為細(xì)胞存活率(%):［(實(shí)驗(yàn)孔A450－調(diào)零孔A450)/(對(duì)照孔A450－調(diào)零孔A450)］×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有操作過程均在避光條件下進(jìn)行。

5 光敏劑Photosan對(duì)Panc－1細(xì)胞PDT作用的機(jī)制

5.1 PDT后Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxidative species，ROS)的測定

①熒光顯微鏡觀察Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧 原理:熒光探針2’，7’－二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)可自由進(jìn)入細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光就可以反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平［6］。方法:配制光敏劑為如下濃度:1、4、8、10 mg/L，并設(shè)不加光敏劑的空白對(duì)照(0 mg/L)。光照劑量如下:1、5、10 J/cm2，并設(shè)不予照射的空白對(duì)照(0 J/cm2)。PDT治療同4.1。PDT后1 h用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH－DA為10 μmol/L，并更換各孔培養(yǎng)基，100 μL/well，置培養(yǎng)箱孵育30 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，置于熒光顯微鏡下觀察并照片。根據(jù)說明書提供的DCF激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，選擇藍(lán)色激發(fā)光，觀察綠色熒光。

②流式細(xì)胞儀測定Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧 光照劑量和光敏劑濃度的設(shè)置、PDT治療、裝載熒光探針DCFH－DA均同①。試驗(yàn)中Panc－1細(xì)胞接種于12孔板，密度為1×108/L，1 mL/well。實(shí)驗(yàn)完畢，收集各組各孔細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，PBS洗滌、重懸后，以流式細(xì)胞儀測定DCF相對(duì)熒光強(qiáng)度。

5.2 流式細(xì)胞儀檢測PDT后Panc－1細(xì)胞凋亡及壞死 Panc－1細(xì)胞接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿，一組照射功率5 J/cm2，光敏劑濃度為 0、2、4、6、8、10、12 mg/L;另一組光敏劑濃度 4 mg/L，照射功率為 0、5、15、20、25。PDT治療同上方法4.1，PDT后24 h收集各組細(xì)胞以流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡和壞死的比率。

5.3 Western blotting檢測 PDT后 Panc－1細(xì)胞caspase－3活性蛋白水平 細(xì)胞標(biāo)本分組如下(包括不加光敏劑且不予照射的空白對(duì)照)，見表1。

表1 Western blotting實(shí)驗(yàn)細(xì)胞標(biāo)本分組Table 1.Cell sample groups of Western blotting test

接種細(xì)胞于直徑6 cm培養(yǎng)皿，PDT方法同上方法4.1，PDT后24 h收集各組細(xì)胞，以Western blotting檢測細(xì)胞caspase－3活性蛋白水平。將X光片用凝膠成像系統(tǒng)在白光下掃描后，應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行吸光度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 光敏劑Photosan對(duì)Panc－1細(xì)胞的PDT效應(yīng)及其影響因素

PDT后24 h CCK－8實(shí)驗(yàn)測得調(diào)零孔A450為0，各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的A450見表2。各孔的細(xì)胞存活率見圖1。

統(tǒng)計(jì)顯示，光敏劑濃度0.5－10 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率總體隨濃度增加而明顯下降;10 mg/L以上，細(xì)胞存活率不再顯著下降;光照劑量1－20 J/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率總體隨劑量增加而明顯下降，20 J/cm2以上，細(xì)胞存活率不再顯著下降。單純給予光敏劑(0 J/cm2)或光照(0 mg/L)，細(xì)胞存活率均不受影響，見圖1。光敏劑濃度和光照劑量之間存在交互作用(P＜0.05)。進(jìn)一步以交互參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷［7］:將代表此二因素交互作用的變量“光敏劑濃度×光照劑量”與A450進(jìn)行線性回歸，得到回歸系數(shù)β=－0.421(P＜0.05)，表明二者之間為協(xié)同作用。

表2 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1經(jīng)不同濃度光敏劑和不同劑量光照后的A450值Table 2.The A450values of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light(.n=3)

表2 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1經(jīng)不同濃度光敏劑和不同劑量光照后的A450值Table 2.The A450values of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light(.n=3)

Photosan concentration(mg/L)Light dose(J/cm2)1.411 ±0.0200.5 1.401±0.040 1.341±0.130 1.330±0.090 1.207±0.130 1.109±0.030 1.108±0.030 1.066±0.030 1.065±0.04011.412±0.090 1.282±0.090 1.198±0.060 1.083±0.050 1.033±0.050 1.002±0.080 0.984±0.060 0.981±0.0402 1.419±0.080 1.254±0.040 1.125±0.090 0.924±0.090 0.995±0.070 0.902±0.070 0.944±0.040 0.924±0.06031.401±0.030 1.258±0.080 1.079±0.060 0.655±0.050 0.863±0.040 0.682±0.050 0.735±0.030 0.793±0.00041.354±0.040 1.200±0.060 0.932±0.100 0.532±0.050 0.562±0.060 0.549±0.040 0.403±0.040 0.438±0.03061.410±0.060 1.197±0.040 0.709±0.060 0.356±0.090 0.212±0.020 0.214±0.010 0.182±0.020 0.206±0.02081.388±0.040 1.110±0.050 0.404±0.040 0.149±0.010 0.121±0.010 0.118±0.010 0.108±0.010 0.118±0.01010 1.367±0.040 0.943±0.050 0.215±0.020 0.107±0.010 0.110±0.010 0.104±0.090 0.099±0.010 0.098±0.01012 1.393±0.050 0.931±0.070 0.164±0.010 0.107±0.020 0.124±0.030 0.124±0.030 0.102±0.0110 15 20 25 3001.415±0.020 1.413±0.020 1.411±0.010 1.409±0.020 1.409±0.020 1.416±0.030 1.415±0.0200150 0.096 ±0.010

Figure 1.Viability of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light.圖1 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1經(jīng)不同濃度光敏劑和不同劑量光照后的細(xì)胞存活率

2 光敏劑Photosan對(duì)人胰腺癌Panc－1細(xì)胞PDT作用的機(jī)制

2.1 PDT后Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧的測定

①熒光顯微鏡觀察Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧 隨光敏劑濃度以及光照劑量的增加，活性氧陽性細(xì)胞數(shù)量增加，且熒光強(qiáng)度相應(yīng)增強(qiáng)，見圖2。

②流式細(xì)胞儀測定Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧 光照劑量為5 J/cm2時(shí)，各濃度組細(xì)胞內(nèi)活性氧的相對(duì)熒光強(qiáng)度見圖3;光敏劑濃度為4 mg/L時(shí)，各光照劑量組細(xì)胞內(nèi)活性氧的相對(duì)熒光強(qiáng)度見圖4。統(tǒng)計(jì)顯示，隨光敏劑濃度的增加，以及隨光照劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧均逐漸增多(P＜0.05)。

Figure 2.ROS production in Panc－1 cells after PDT(fluorescence microscope，×40).A:Photosan 0 mg/L，light dose 0 J/cm2(control);B:Photosan 4 mg/L，light dose 1 J/cm2;C:Photosan 8 mg/L，light dose 5 J/cm2;D:Photosan 10 mg/L，light dose 5 J/cm2.圖2 PDT后Panc－1細(xì)胞內(nèi)活性氧陽性細(xì)胞數(shù)量

Figure 3.Impact of Photosan concentration on intracellular ROS production(light dose=5 J/cm2).圖3 光敏劑濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

Figure 4.Impact of light dose on intracellular ROS(Photosan concentration=4 mg/L).圖4 光照劑量對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

2.2 流式細(xì)胞儀檢測PDT后Panc－1細(xì)胞凋亡及壞死 光照劑量為5 J/cm2時(shí)各濃度組的細(xì)胞凋亡率和壞死率，以及光敏劑濃度為4 mg/L時(shí)各光照劑量組的細(xì)胞凋亡率和壞死率見圖5、6。

Figure 5.Rates of apoptosis and necrosis in groups of Photosan concentration when light dose was 5 J/cm2.*P ＜0.05 vs necrosis group.圖5 光照劑量為5 J/cm2時(shí)各光敏劑濃度組的細(xì)胞凋亡率和壞死率

Figure 6.Rates of apoptosis and necrosis in groups of light dose when Photosan concentration was 4 mg/L.*P ＜0.05 vs necrosis group.圖6 光敏劑濃度為4 mg/L時(shí)各光照劑量組的細(xì)胞凋亡率和壞死率

統(tǒng)計(jì)顯示，當(dāng)光照劑量恒定時(shí)，細(xì)胞凋亡率和壞死率均隨光敏劑濃度增加而增加;當(dāng)光敏劑濃度恒定時(shí)，凋亡率和壞死率均隨光照劑量增加而增加，但兩種情況下均表現(xiàn)凋亡率＞壞死率(P＜0.05)，表明細(xì)胞的損傷以凋亡為主。

2.3 Western blotting檢測 PDT后 Panc－1細(xì)胞caspase－3活性蛋白水平 結(jié)果見圖7。PDT后與PDT前(1)比，caspase－3水平明顯增強(qiáng)。并且隨光敏劑濃度增加(2－6)、隨光照劑量增加(7、4、8)，caspase－3水平相應(yīng)增強(qiáng)(P＜0.05)。

Figure 7.Expression of activated caspase－3 protein in Panc－1 cells after PDT detected by Western blotting.圖7 Western blotting檢測PDT后Panc－1細(xì)胞caspase－3蛋白表達(dá)

討 論

1 血卟啉光動(dòng)力治療對(duì)人胰腺癌細(xì)胞Panc－1的效應(yīng)及其影響因素

實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析顯示:光動(dòng)力治療對(duì)Panc－1細(xì)胞具有明確的殺傷效應(yīng)。但是，單純給予光敏劑或單純進(jìn)行光照，則無PDT效應(yīng)，說明光敏劑和特定波長的光照是光動(dòng)力殺傷腫瘤細(xì)胞作用中缺一不可的重要因素，這符合光動(dòng)力治療的基本特點(diǎn)［8］。同時(shí)也提示:光敏劑或相應(yīng)波長的激光，并不具備獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)，正常組織單獨(dú)接觸時(shí)可能是安全的。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著光敏劑濃度和光照劑量的增加，PDT對(duì)細(xì)胞殺傷作用相應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)光敏劑達(dá)到10 mg/L，光照劑量達(dá)到15 J/cm2時(shí)，這一作用趨向達(dá)到最大。對(duì)此的解釋是:(1)由于光敏劑濃度對(duì)PDT效應(yīng)的影響是通過細(xì)胞內(nèi)光敏劑含量產(chǎn)生的。而細(xì)胞內(nèi)光敏劑含量取決于細(xì)胞對(duì)其的攝取和“排泄”［9］過程，在光敏劑濃度較低時(shí)，細(xì)胞對(duì)其攝取超過排泄，當(dāng)濃度增加到一定程度，攝取與排泄達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，這時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)光敏劑的“飽和”現(xiàn)象。(2)另一個(gè)影響光敏劑效應(yīng)的因素是熒光猝滅現(xiàn)象，這是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子之間或其自身分子之間發(fā)生的相互作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱或消失的現(xiàn)象［10］。由于Photosan中大卟啉環(huán)之間的堆疊作用(稱為π－π堆積)，將導(dǎo)致分子之間的熒光猝滅而削弱其光敏活性，并隨濃度增高而逐漸明顯［11］。(3)這也可能與細(xì)胞內(nèi)參與結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)光敏劑的受體已全部動(dòng)員有關(guān)。光照劑量對(duì)PDT效應(yīng)的影響則與其所引發(fā)光敏劑產(chǎn)生的光化學(xué)反應(yīng)隨照射能量的逐漸增大最終達(dá)到“飽和”有關(guān)。

另外，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，光敏劑濃度與光照劑量之間存在交互作用。為進(jìn)一步明確該交互作用的類型及其影響，我們進(jìn)行了交互系數(shù)的統(tǒng)計(jì)推斷。當(dāng)該系數(shù)β≠0時(shí)，表示存在光敏劑濃度和光照劑量之間的交互作用，而β的正負(fù)則表示交互作用對(duì)因變量的作用是增強(qiáng)還是減弱［7］。經(jīng)計(jì)算得到β=－0.421，表明光敏劑濃度和關(guān)照劑量的交互作用是協(xié)同降低細(xì)胞存活率。這一現(xiàn)象的原因尚不清楚，但對(duì)臨床工作可能提供有意的指導(dǎo)。比如，為提高療效可以通過增加少許光照劑量而不必投入更多的光敏劑，從而減少大劑量光敏劑對(duì)皮膚光敏損傷等副作用的風(fēng)險(xiǎn)以及熒光猝滅現(xiàn)象的不利影響;而且增加光照劑量幾乎不需增加費(fèi)用，但光敏劑的增加將顯著增加病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。曾有學(xué)者認(rèn)為光敏劑濃度和光照劑量之間并無明顯互惠作用，原因之一可能是光照對(duì)光敏劑的破壞而使其消耗，該現(xiàn)象稱為光漂白(photobleaching)［12］。而由于光漂白效應(yīng)與光敏劑自身特性及其所處的體系有很大關(guān)系，因此尚需更多的研究來探討光漂白對(duì)光敏劑濃度和光照劑量之間關(guān)系的影響。

2 光敏劑Photosan對(duì)人胰腺癌Panc－1細(xì)胞PDT作用的機(jī)制

光動(dòng)力對(duì)腫瘤的治療涉及非常復(fù)雜的光化學(xué)和光生物學(xué)反應(yīng)，其機(jī)制至今尚不十分明確，但基本原理是腫瘤組織吸收光敏劑后，經(jīng)特定波長的光照射，在生物組織中氧的參與下產(chǎn)生含氧自由基和/或單線態(tài)氧，ROS破壞腫瘤細(xì)胞［13］。本研究從上述各階段探討了光敏劑Photosan對(duì)人胰腺癌Panc－1細(xì)胞的作用機(jī)制。

2.1 PDT激發(fā)活性氧的產(chǎn)生 熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)均檢測到PDT后Panc－1細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了活性氧，這符合光動(dòng)力反應(yīng)的基本規(guī)律，并且從定性和定量兩個(gè)方面均顯示，隨光敏劑濃度、光照劑量增加，活性氧的產(chǎn)生相應(yīng)增多。這是由于提高光敏劑濃度增加了細(xì)胞內(nèi)光化學(xué)反應(yīng)的底物－光敏物質(zhì)，而光照劑量的增強(qiáng)則使單位質(zhì)量的底物吸收更多的能量，最終均通過能量傳遞使活性氧產(chǎn)生增多。這也必將導(dǎo)致最終對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷效應(yīng)。

2.2 PDT殺傷效應(yīng)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主 腫瘤細(xì)胞的破壞死亡分為凋亡和壞死，本研究結(jié)果顯示PDT后24 h細(xì)胞凋亡和壞死兩種形式都存在，并且與光敏劑濃度以及光照劑量呈正相關(guān)，但凋亡細(xì)胞的比例始終高于壞死比例，提示PDT對(duì)細(xì)胞的破壞以凋亡為主。

目前的研究認(rèn)為，PDT可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，也可引起壞死，這取決于細(xì)胞的種類和PDT的劑量(包括光敏劑和光照劑量)。有學(xué)者［14］發(fā)現(xiàn):當(dāng)PDT劑量較小時(shí)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死的刺激因素較弱，細(xì)胞凋亡起主要作用;而當(dāng)刺激因素逐漸增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞逐漸過渡到以壞死為主。至今仍無一種統(tǒng)一的機(jī)制來解釋這種現(xiàn)象。

本研究認(rèn)為，引起上述分歧的原因之一可能在于對(duì)凋亡細(xì)胞檢測時(shí)機(jī)的把握。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，典型的凋亡特征往往出現(xiàn)在PDT后凋亡的早期或中期，此時(shí)細(xì)胞膜尚完整，不管是形態(tài)學(xué)還是熒光染色都容易確定凋亡的特征，若檢測時(shí)間過遲，細(xì)胞的凋亡已發(fā)展至接近甚至已經(jīng)死亡，則很難與壞死鑒別。當(dāng)PDT劑量較大時(shí)，強(qiáng)大的光動(dòng)力作用使細(xì)胞很快就發(fā)生一系列生化和病理改變而死亡，如果不注意把握時(shí)機(jī)及時(shí)檢測，可能會(huì)造成細(xì)胞以壞死為主的假象。當(dāng)然，這一問題仍待今后大量的研究予以進(jìn)一步闡明。

2.3 Photosan誘導(dǎo)Panc－1細(xì)胞凋亡的機(jī)制初探PDT導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制涉及不同的光敏劑在亞細(xì)胞內(nèi)的定位、凋亡信號(hào)的觸發(fā)及其在細(xì)胞內(nèi)的各種傳導(dǎo)途徑等極其復(fù)雜的諸多環(huán)節(jié)。本研究為初步探討Photosan對(duì)Panc－1細(xì)胞PDT后凋亡的現(xiàn)象及其可能機(jī)制，選擇了caspase－3作為研究目標(biāo)，結(jié)果顯示隨光敏劑濃度以及光照劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)caspase－3水平相應(yīng)增加，表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Caspase家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行凋亡的最終途徑。其中caspase－3被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，一旦被激活，即發(fā)生下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生凋亡［15－17］。

綜上所述，我們認(rèn)為被細(xì)胞吸收后分布于細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜(如線粒體膜)等的光敏劑經(jīng)PDT后產(chǎn)生各種活性氧成分，觸發(fā)了凋亡的外途徑和/或內(nèi)途徑，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活caspase－3，并且隨光敏劑和光照劑量的增加，使該蛋白酶的激活更加顯著。caspase－3的激活可以通過(1)酶解滅活凋亡抑制物，如Bcl－2等;(2)酶解細(xì)胞外基質(zhì)及骨架蛋白，如角質(zhì)蛋白等;(3)裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子，如聚ADP核糖多聚酶等，最終使細(xì)胞的功能和形態(tài)發(fā)生變化而凋亡［18］。

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