1，25－二羥維生素D3抑制被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞的增殖

宋穎芳， 賴國祥△， 戚好文， 吳昌歸

(1 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州350025;2 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安710032)

氣道重塑是哮喘慢性化及嚴(yán)重化的基礎(chǔ)。在涉及氣道重塑的眾多細(xì)胞中，氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。甾體激素1，25－二羥維生素D3［1，25－dihydroxyvitamin D3，1，25－(OH)2D3］是維生素D(vitamin D)的活性代謝產(chǎn)物，它不僅在骨骼代謝及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，而且對細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程也具重要的調(diào)節(jié)作用［1］。先前研究發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3對多種正常細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖存在負(fù)性調(diào)節(jié)作用［2］。但迄今為止，國內(nèi)外尚無關(guān)于1，25－(OH)2D3對被動致敏的人氣道平滑肌細(xì)胞(human airway smooth muscle cells，HASMCs)調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究報道。本研究觀察1，25－(OH)2D3對被動致敏的HASMCs 增殖的影響，探討其在氣道重塑中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

HASMCs 購自Sciencell。MTT 和胰蛋白酶購自Sigma。DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco。胎牛血清購于杭州四季青生物公司。羊抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)mAb 和SABC 試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。

2 HASMCs 的培養(yǎng)

HASMCs 置于含10%胎牛血清的高糖DMEM 液，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

3 細(xì)胞分組

所有的實驗均需要對細(xì)胞進(jìn)行同步化處理:待傳代細(xì)胞貼壁后，棄上清液，隨后將細(xì)胞隨機(jī)分成3 組:對照組、哮喘組及1，25－(OH)2D3組。對照血清及哮喘血清參照文獻(xiàn)予以制備［3］。用無血清的DMEM 液同步化對照組及哮喘組的細(xì)胞，而1，25－(OH)2D3組予以含1，25－(OH)2D3的無血清DMEM 液進(jìn)行細(xì)胞同步化，同步化48 h 后，對照組加入含10%對照血清的DMEM 液，而哮喘組與1，25－(OH)2D3組均加入含10%哮喘血清的DMEM 液。

4 MTT 法檢測HASMCs 的增殖活性

4.1 確定1，25－(OH)2D3的最佳作用濃度 取對數(shù)生長期HASMCs 以6 ×103cells/well 接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，依上述方法分組，1，25－(OH)2D3組分4 個亞組:分別加入10－7、10－8、10－9、10－10mol/L 1，25－(OH)2D3，孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)48 h 后向每孔加入MTT 液20 μL，繼續(xù)孵箱內(nèi)培養(yǎng)4 h 后，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μL 振蕩10 min 后，選擇492 nm 波長用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(A492nm值)，據(jù)此確定1，25－(OH)2D3最佳作用濃度。

4.2 繪制HASMCs 的細(xì)胞生長曲線 確定10－7mol/L 作為1，25－二羥維生素D3最佳濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞接種密度為8 ×103cells/well，實驗步驟基本同上，分別于血清刺激后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 及72 h 各取一塊培養(yǎng)板，檢測A492nm值，繪制細(xì)胞的生長曲線。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HASMCs 的細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期HASMCs 接種于75 mL 培養(yǎng)瓶內(nèi)，依上述方法進(jìn)行分組，1，25－(OH)2D3組加入10－7mol/L 1，25－(OH)2D3，孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)48 h 后快速胰酶消化收獲各組細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，冰PBS 洗滌2 次，75%冰乙醇固定并4 ℃靜置過夜，而后按常規(guī)方法碘化吡啶染色，室溫放置30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，計算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferative index，PI)，PI =(S +G2/M)/(G0/G1+S +G2/M)×100%。

6 PCNA 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

取對數(shù)生長期HASMCs 接種于內(nèi)置蓋玻片的24 孔培養(yǎng)板，依上述方法進(jìn)行分組，1，25－(OH)2D3組加入10－7mol/L 1，25－(OH)2D3，孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)48 h 后取出細(xì)胞爬片，PBS洗2 次，4%多聚甲醛固定，常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)SABC 法染色，以羊抗人PCNA 抗體作為I 抗(1∶100 稀釋)，用PBS 代替特異性I 抗進(jìn)行陰性對照。最后DAB 顯色，封片后鏡下觀察。顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個高倍視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞，計算PCNA 陽性率(陽性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù))。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 MTT 法檢測1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 增殖活力的影響

10－10mol/L 1，25－(OH)2D3組與哮喘組A492nm值無明顯差異(P ＞0.05);而其它濃度的1，25－(OH)2D3組A492nm值均較哮喘組明顯下降，且各濃度組間差異顯著，其中10－7mol/L 1，25－(OH)2D3組抑制作用最為明顯。故選取10－7mol/L 1，25－(OH)2D3為最佳濃度用于后續(xù)的實驗研究，見圖1。

10－7mol/L 1，25－(OH)2D3對被動致敏HASMCs 增殖的抑制作用表現(xiàn)為時間依賴性，見圖2。

2 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 細(xì)胞周期的影響

1，25－(OH)2D3顯著降低哮喘血清刺激后HASMCs 的PI，即明顯增加哮喘血清刺激的G0/G1期細(xì)胞比例，而相應(yīng)地減少了S 及G2/M 期細(xì)胞比例，即阻止細(xì)胞由G0/G1期向S 期的轉(zhuǎn)化，見表1。

Figure 1. Inhibitory effect of 1，25－(OH)2D3 on the proliferation of passively－sensitized HASMCs. 1:control group;2:asthma group;3:10 －10 mol/L 1，25－(OH)2D3 group;4:10 －9 mol/L 1，25－(OH)2D3 group;5:10 －8 mol/L 1，25－(OH)2D3 group;6:10 －7 mol/L 1，25－(OH)2D3 group. ±s.n=8. #P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs asthma group.圖1 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 增殖的抑制作用

Figure 2. Growth curve of HASMCs treated with 1，25－(OH)2D3 at the concentration of 10 －7 mol/L. ±s.n=8. * P ＜0. 05 vs control group;△P ＜0. 05 vs asthma group.圖2 10 －7 mol/L 1，25－(OH)2D3 作用下的細(xì)胞生長曲線

表1 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 細(xì)胞周期的影響Table 1. Effect of 1，25－(OH)2D3 on cell cycle of passivelysensitized HASMCs(%. ±s.n=3)

表1 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 細(xì)胞周期的影響Table 1. Effect of 1，25－(OH)2D3 on cell cycle of passivelysensitized HASMCs(%. ±s.n=3)

* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs asthma group.

Group G0/G1 S G2/M PI Control 73.87±0.80 16.47±0.69 9.67±0.73 26.13±0.87 Asthma 63.33±0.68* 20.27±1.32* 16.40±1.52* 36.93±0.94*1，25－(OH)2D3 69.30±0.62＊△14.83±0.67＊△15.87±1.29＊△ 30.75±1.62＊△

3 PCNA 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

HASMCs 經(jīng)哮喘血清刺激48 h 后，細(xì)胞核著色呈褐色，PCNA 陽性 率 為(65. 74 ± 2. 59)%。10－7mol/L 1，25－(OH)2D3預(yù)處理HASMCs 后，細(xì)胞核著色呈棕褐色，PCNA陽性率為(54.57 ±1.72)%。而對照組細(xì)胞著色呈淺褐色，PCNA 表達(dá)率僅為(50.07 ±1.37)%，見圖3。

討 論

隨著哮喘的慢性化及嚴(yán)重化，它表現(xiàn)出了固定性氣道阻塞及激素抵抗等新特征。氣道重塑是所有這些新特征的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其特征性病理學(xué)改變是氣道平滑肌層的增厚。ASMCs 是平滑肌層主要組成部分，作為氣道重塑的關(guān)鍵性參與細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，它在氣道重建中發(fā)揮著重要的作用，研發(fā)抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖的藥物已成為防治哮喘相關(guān)性氣道重塑的熱點之一。

抑制多種類型細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和分化是除免疫調(diào)節(jié)作用外1，25－(OH)2D3的另一重要的骨外作用。既往研究已從體內(nèi)水平證實1，25－(OH)2D3對ASMCs 的抗增殖作用［4］，但體內(nèi)環(huán)境下的ASMCs 是一個三維的特殊細(xì)胞群體，具有獨特的微環(huán)境，在細(xì)胞－細(xì)胞、細(xì)胞－微環(huán)境之間存在著廣泛的聯(lián)系。因此體內(nèi)實驗所發(fā)現(xiàn)的1，25－(OH)2D3對ASMCs 的抗增殖作用是其直接的抑制作用還是其通過細(xì)胞之間的相互作用和信號傳遞而發(fā)揮的間接抑制作用，尚不明確。

Figure 3. Immunocytochemical staining for PCNA in HASMCs of each group (DAB staining，×100).圖3 HASMCs 的PCNA 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

實驗首先采用MTT 法檢測在10－10－10－7mol/L 濃度范圍內(nèi)1，25－(OH)2D3對被動致敏HASMCs 增殖活力的影響。10－10mol/L 接近1，25－(OH)2D3在體內(nèi)的生理濃度［5］，從10－9mol/L 的濃度開始，1，25－(OH)2D3對HASMCs 增殖有明顯的抑制作用，且這種作用表現(xiàn)為濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到10－7mol/L 時，1，25－(OH)2D3抗細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)并呈現(xiàn)時間依賴性。10－6mol/L 是目前推薦的1，25－(OH)2D3發(fā)揮有效治療效應(yīng)的血漿濃度(即藥理濃度)［6］，但這種治療劑量的應(yīng)用易誘發(fā)機(jī)體的高鈣血癥，因此一定程度上1，25－(OH)2D3被嚴(yán)格限制了其在臨床上的應(yīng)用。另有研究還發(fā)現(xiàn)10－6mol/L 1，25－(OH)2D3對SMCs 的調(diào)節(jié)作用僅稍強(qiáng)于10－7mol/L 1，25－(OH)2D3［7］。鑒于此考慮，本實驗并未選用10－6mol/L 這一濃度。從實驗結(jié)果可以看出10－7mol/L 1，25－(OH)2D3已能顯著抑制被動致敏HASMCs 的增殖及分泌功能，它為臨床運(yùn)用低劑量1，25－(OH)2D3的可行性提供了初步的理論支持。

PCNA 又稱周期蛋白，是DNA 聚合酶δ 及細(xì)胞復(fù)制DNA的必須成分，其表達(dá)與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，已成為評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項客觀指標(biāo)［8］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3組HASMCs 的PCNA 陽性率明顯低于哮喘組，間接證實1，25－(OH)2D3的干預(yù)能顯著抑制被動致敏HASMCs的細(xì)胞增殖，此結(jié)果與上述的MTT 法觀察結(jié)果相一致。

細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最終共同通路，進(jìn)入細(xì)胞周期和細(xì)胞周期的推進(jìn)是哮喘ASMCs 增殖的關(guān)鍵事件?，F(xiàn)有資料表明1，25－(OH)2D3具有特異性細(xì)胞周期抑制作用，能特異性阻斷癌細(xì)胞由G1期向S 期的轉(zhuǎn)化［9，10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3對HASMCs 的細(xì)胞周期也具有同樣的特異性抑制作用，它能阻滯細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S 期，引起G0/G1期細(xì)胞堆積，造成處于增殖狀態(tài)的S 期及G2/M期細(xì)胞數(shù)目下降，進(jìn)而抑制被動致敏HASMCs 的細(xì)胞增殖。

1，25－(OH)2D3主要通過與其受體VDR 的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。新近研究證實VDR 基因是哮喘的新易感基因，提示1，25－(OH)2D3可通過與VDR 的配體－受體效應(yīng)參與對哮喘的調(diào)節(jié)作用［11］。大量的流行病學(xué)、臨床學(xué)及免疫學(xué)資料已證實1，25－(OH)2D3在哮喘的免疫應(yīng)答及慢性氣道炎癥方面均發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)控作用［12－14］，本研究采用被動致敏技術(shù)，發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3對哮喘狀態(tài)下HASMCs 增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，間接證實了其對哮喘氣道重塑的抑制作用。新近臨床研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體的維生素D 水平與肺功能呈正相關(guān)［15］，本研究結(jié)果亦從細(xì)胞及分子水平為其提供了一個可能的合理性解釋，展示了1，25－(OH)2D3潛在的改善肺功能及氣道重塑的能力。

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